PCR a genei mecA

Un fragment de 188-bp în cadrul genei mecA și un fragment de 178-bp în cadrul genei S. aureus specifică genei Sa442 aureus au fost amplificate pentru izolatele 1 și 2 în reacții separate pe un LightCycler (Roche Diagnostics GmbH, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Germania) folosind SYBR green cu amorsele Mec-S și Mec-A sau Sa442-F și, respectiv, Sa442-RS, așa cum a fost descris anterior (5). izolatele mecA-pozitive generează temperaturi de topire SYBR green de 79°C. Izolații Sa442-pozitivi generează, de asemenea, o temperatură de topire SYBR verde de 79°C. S. aureus ATCC 29213 (sensibil la oxacilină) și S. aureus ATCC 43300 (rezistent la oxacilină) au fost utilizate ca martori pentru gena Sa442 și, respectiv, ca martori negativi și pozitivi pentru gena mecA. Spre deosebire de martori, nu s-a obținut niciun produs mecA sau Sa442 pentru izolatele 1 și 2. S-a efectuat o PCR suplimentară pentru a detecta un fragment mai mare de 533-bp al genei mecA (4). Nu a fost generat nici un produs la izolatele 1 ș i 2 sau la S. aureus ATCC 29213, dar un produs de dimensiunea așteptată a fost generat de S. aureus ATCC 43300. Gena ARNr 16S, utilizată ca martor pozitiv, a fost amplificată de la toate tulpinile (datele nu sunt prezentate).

Detecția precisă și la timp a rezistenței la meticilină la S. aureus este o funcție importantă a laboratorului de microbiologie clinică (20). În timp ce detectarea genei mecA prin PCR este standardul de aur, testul de aglutinare cu latex PBP2a s-a dovedit a fi un test simplu și rapid, cu caracteristici bune de performanță pentru detectarea rezistenței la meticilină atât la S. aureus, cât și la speciile stafilococice coagulazo-negative, în pofida necesității unei inducții prealabile în unele cazuri (1, 21). Testul PBP2a utilizează particule de latex sensibilizate cu anticorpi monoclonali crescuți împotriva PBP2a (11). Se pare că specificitatea acestui test se apropie de 100 % (18, 19). Deși nu există rapoarte cu privire la performanța testelor de aglutinare a latexului PBP2a pentru izolatele de S. intermedius, au fost observate rezultate fals pozitive la PBP2a în cazul a două izolate de S. warneri, unul la 1 min și celălalt la 6 min, care au fost ambele mecA PCR negative cu o CMI pentru oxacilină de ≤0,5 μg/ml (21). Conform prospectului producătorului, reacțiile fals-pozitive sunt, în general, aglutinații slabe care sunt adesea negative la testarea repetată cu o cultură proaspătă. Cu toate acestea, am constatat că cele două izolate ale noastre au fost pozitive în mod repetat după mai multe subculturi, una dintre ele fiind puternic pozitivă. Tulpina S. intermedius ATCC 29663 a fost, de fapt, negativă prin testul PBP2a, dar a fost, de asemenea, diferită din punct de vedere fenotipic de cele două tulpini clinice în ceea ce priveș te fermentația pozitivă a manitolului, negativitatea β-lactamazei ș i sensibilitatea la penicilină (rezultatele nu sunt prezentate).

Posibilitatea coagulazei este utilizată în mod obișnuit pentru a atribui semnificație clinică și patogenitate izolatelor de Staphylococcus spp. În timp ce S. aureus este cel mai frecvent stafilococ pozitiv la coagulază izolat în laboratorul clinic, S. intermedius, S. delphini, S. schleiferi subsp. coagulans, S. lutrae și unele tulpini de S. hyicus sunt, de asemenea, pozitive la coagulază (1). Laboratoarele folosesc adesea o combinație de teste pentru detectarea coagulazei libere sau a factorului de coagulare cu și fără proteină A pentru a identifica stafilococii coagulazopozitivi. Izolații de S. intermedius sunt pozitivi pentru coagulază liberă, dar sunt negativi pentru proteina A, iar 14 % dintre izolați au un factor de aglomerare, ceea ce ar explica coagulază pozitivă la lamă și BACTi Staph latex slab pozitiv pentru izolatul 1 (6). Așa cum am descris anterior, am constatat că pozitivitatea pirrolidonil arilamidazei este o modalitate rapidă de a determina că un stafilococ cu coagulază pozitivă nu este S. aureus (10). Considerăm că cazurile noastre sugerează că adevărata incidență a S. intermedius în infecțiile rănilor umane este probabil subestimată, deoarece toți stafilococii coagulazo-pozitivi sunt adesea grupați împreună ca S. aureus (17). În absența identificării definitive a S. intermedius prin metode fenotipice sau biochimice, secvențierea genei ARNr 16S s-a dovedit a fi utilă pentru clasificarea taxonomică a speciilor de Staphylococcus și Macrococcus (8).

Un studiu inițial din 1989 a arătat că 72% dintre izolatele de S. intermedius din gingia canină și din infecțiile rănilor provocate de canini erau sensibile la penicilină și niciuna nu era rezistentă la oxacilină (16). Un studiu mai recent a arătat că rezistența la oxacilină este o problemă din ce în ce mai mare în cazul izolatelor de S. intermedius, fiind observate rate de rezistență la oxacilină cu 60 până la 85% mai mari pentru izolatele din nas, ochi și abcese ale câinilor în comparație cu cele din celelalte zone (7). În prima infecție umană cauzată de S. intermedius rezistent la meticilină, în care acesta a fost agentul cauzal al pneumoniei, CMI de oxacilină a fost de 32 μg/ml (3). Ambele izolate ale noastre au fost rezistente la penicilină și au fost β-lactamaze pozitive; CMI de oxacilină pentru aceste izolate a fost de 0,125 μg/ml. Rezistența la penicilină la aceste izolate, în absența rezistenței la oxacilină cu o PCR mecA negativă și a sensibilității la combinații de inhibitori de β-lactame/β-lactamază, poate fi explicată prin rezultatul pozitiv al testului β-lactamazei. Utilizând setul de amorsă care vizează un fragment de 533-bp al genei mecA, Gortel et al. au confirmat că gena mecA conferă rezistență la meticilină la stafilococii izolați de la câini (4). Acești cercetători au constatat că, dintre cele 10 tulpini stafilococice coagulazo-pozitive purtătoare de mecA, 9 erau S. aureus și 1 era S. intermedius. Aceștia au emis ipoteza că diferența de prevalență a rezistenței la meticilină la S. intermedius în comparație cu S. aureus s-a datorat unei diferențe de reglementare mecA între specii sau lipsei unei presiuni intense de selecție a antibioticelor asupra S. intermedius (4). Deși nu există criterii interpretative specifice ale NCCLS pentru stafilococi coagulazo-pozitivi, alții decât S. aureus, rezultatele testelor de sensibilitate la oxacilină prin metode fenotipice și genotipice (PCR a genei mecA utilizând două seturi de amorsă care vizează fragmente de 188 și 533 bp), combinate cu CMI de oxacilină scăzute în comparație cu cele raportate anterior pentru S. aureus rezistent la oxacilină. intermedius izolate (MIC > 4 μg/ml), stabilește că izolatele 1 și 2 din acest studiu sunt sensibile la oxacilină (3, 4).

Este bine acceptat faptul că rezistența la meticilină la S. aureus se datorează în principal achiziției unei proteine suplimentare de legare a penicilinei, PBP2a, codificată de gena mecA. O căutare a originii genei mecA a dus la identificarea unui posibil precursor evolutiv în S. sciuri, un comensal al animalelor. Omologul mecA din S. sciuri a prezentat o similitudine de 79,5% a secvenței ADN cu gena mecA din S. aureus și o identitate de 88% a aminoacizilor cu PBP2a. Omologul mecA din S. sciuri nu conferă rezistență la meticilină în natură. Cu toate acestea, Couto et al. au identificat izolate de S. sciuri rezistente la meticilină de la oameni, în cazul în care supraexprimarea omologului mecA, rezultată prin inserția unui element IS256 în amonte de gena structurală sau prin modificări de un singur nucleotid în regiunea promotoare, a dus la producerea unei proteine asemănătoare din punct de vedere funcțional cu PBP2a (2). La fel ca în cazul izolatelor de S. sciuri, izolatele de S. intermedius descrise aici pot conține un omolog mecA care codifică o proteină asemănătoare cu PBP2a, care reacționează încrucișat cu testul de aglutinare cu latex PBP2a, dar care nu conferă rezistență la meticilină. Este posibil, de asemenea, un mimetism antigenic cu o proteină complet străină. În ambele cazuri, sperăm să sensibilizăm comunitatea microbiologică cu privire la faptul că există izolate clinice care pot contesta specificitatea testului de aglutinare cu latex PBP2a.

În concluzie, oferim primul raport de rezultate fals pozitive la PBP2a pentru două tulpini de S. intermedius care, combinate cu o eroare inițială în interpretarea testelor fenotipice, au dus la o identificare greșită ca fiind MRSA. Rezultatele PBP2a fals pozitive ar putea duce la încercări de control al infecției greșit direcționate, la utilizarea inutilă a antibioticelor, cum ar fi vancomicina, și la o creștere generală a cheltuielilor spitalicești (20). Aceste cazuri subliniază importanța urmăririi active a rezultatelor discrepante ale testelor de laborator pentru a evita erorile de raportare. Identificarea exactă a speciilor de stafilococi coagulazo-pozitivi este esențială pentru a determina patogenitatea, semnificația clinică, modelele de sensibilitate și epidemiologia izolatelor clinice.

.