La om, aproximativ 5 până la 8 litri de aer intră și ies din plămâni pe minut în repaus. Aerul poate varia în concentrația de oxigen și CO2, poate transporta alergeni și conferă diferite grade de întindere mecanică a căilor respiratorii și a suprafețelor de schimb de gaze. Aceste semnale sunt detectate, retransmise și procesate în ieșiri fiziologice, cum ar fi controlul tensiunii arteriale pulmonare, răspunsurile imune și ritmul respirației, dar mecanismul este neclar. Celulele neuroendocrine pulmonare (PNEC) se găsesc într-o gamă largă de organisme, de la pești la mamifere (1). În plămânul mamiferelor, PNECs sunt singurele celule epiteliale ale căilor respiratorii inervate și reprezintă mai puțin de 1% din populația totală de celule epiteliale pulmonare (2). Deși dovezile in vitro au implicat PNEC în detectarea oxigenului, în tonusul mușchilor netezi bronșici și vasculari și în răspunsurile imune (1, 3), aceste roluri nu au fost demonstrate in vivo. Un studiu recent a arătat că ablația genetică a PNECs la adult nu a compromis homeostazia sau repararea căilor respiratorii, lăsând sub semnul întrebării importanța in vivo a acestor celule (4). Patologiile PNEC, în special o creștere a numărului de PNEC, au fost documentate într-o gamă largă de boli pulmonare, inclusiv astmul, displazia bronhopulmonară, fibroza chistică, boala pulmonară obstructivă cronică, hernia diafragmatică congenitală, hiperplazia neuroendocrină a sugarului, sindromul morții subite a sugarului și hipertensiunea pulmonară (5-8). În fiecare caz, rămâne neclar dacă creșterea PNEC este o cauză sau o consecință a simptomelor.

În plămânul de șoarece, majoritatea PNEC-urilor rezidă în grupuri de ~3 până la 20 de celule numite corpuri neuroepiteliale (NEB) (3, 9). Atât PNEC-urile solitare, cât și cele grupate conțin vezicule centrale dense, umplute cu neuropeptide bioactive, cum ar fi peptida legată de gena calcitoninei (CGRP) sau amine, cum ar fi serotonina (1). Acestea sunt eliberate ca răspuns la stimuli, cum ar fi modificările nivelului de oxigen. Neuropeptidele și aminele au fost implicate în unele dintre aceleași procese ca și PNEC (10-12), ceea ce ridică posibilitatea ca acestea să medieze funcția PNEC. Cu toate acestea, o legătură de cauzalitate nu a fost demonstrată in vivo.

Am inițiat studiul actual pentru a descoperi mecanismele care stau la baza herniei diafragmatice congenitale (CDH), un defect congenital asociat cu disfuncții pulmonare considerabile, inclusiv un răspuns imunitar crescut și hipertensiune pulmonară (13). Într-un model genetic de șoarece de CDH, am descoperit un defect de grupare nereușită a PNEC. Acesta este urmat de o secvență de evenimente: o creștere a neuropeptidelor PNEC, o creștere a infiltratelor imune și remodelarea structurii pulmonare. Aceste constatări oferă o demonstrație in vivo a funcției PNEC. Deoarece modificările numărului de PNEC și ale neuropeptidelor asociate au fost documentate în multe boli pulmonare, rezultatele noastre au implicații largi, dincolo de CDH.

La om, mutațiile în genele receptorului rotund (ROBO) au fost asociate cu CDH (13, 14). Pentru a studia defectele pulmonare asociate cu CDH, am inactivat atât Robo1, cât și Robo2 în epiteliul derivat din endoderm, inclusiv în plămâni, folosind Shhcre (în continuare Shhcre;Robo mutant) la șoareci (15, 16). Deși acești mutanți supraviețuiesc, aceștia prezintă o suprafață redusă de schimb de gaze începând cu ziua postnatală (P) 15 (Fig. 1, A și B, și fig. S1). Am efectuat microarray-uri urmate de reacția cantitativă în lanț a polimerazei cu transcriptază inversă (qRT-PCR) la P7, înainte de reducerea suprafeței de schimb de gaze. Cincisprezece dintre primele 20 de gene exprimate diferențiat au fost implicate în răspunsurile imune și toate sunt semnificativ crescute, inclusiv Ccl3, Cxcl2, Tnfa și Saa3 (Fig. 1C). În concordanță cu această semnătură, am observat un număr crescut de celule imune, inclusiv neutrofile, eozinofile, macrofage și celule T (Fig. 1, D și E, și fig. S2). În plus, există o creștere a proporției de macrofage M2 și o scădere a proporției de macrofage M1 (fig. S3). Aceste constatări indică faptul că mutanții Shhcre;Robo prezintă o sensibilitate imunitară crescută, imitând o comorbiditate comună a CDH (13).

Deși Robo este exprimat în regiunea alveolară a mezenchimului pulmonar (fig. S4), expresia sa în epiteliu este limitată la celule rare de-a lungul căilor respiratorii (fig. 1F). Colaborarea cu anticorpul CGRP a arătat că celulele epiteliale care exprimă Robo sunt PNEC (Fig. 1G). Pentru a confirma faptul că genele Robo sunt necesare în cadrul PNEC-urilor pentru funcționare, am inactivat Robo folosind Ascl1creERT2 (17), un driver knock-in cre care conferă o activitate specifică PNEC în epiteliul pulmonar (fig. S5). Am constatat că mutanții Ascl1creERT2;Robo au prezentat atât simplificarea alveolară, cât și creșterea macrofagelor, recapitulând fenotipurile Shhcre;Robo (fig. S6). Aceste constatări demonstrează împreună că Robo este necesar în mod specific în PNEC pentru a restricționa numărul de celule imune și pentru a preveni simplificarea alveolară.

În ziua embrionară (E) 13,5, PNEC nou specificate erau celule solitare atât în plămânii de control, cât și în plămânii mutanților Shhcre;Robo (fig. 2, A și B). Până la E15,5, majoritatea PNEC-urilor s-au agregat în NEB-uri la control. Cu toate acestea, PNEC-urile nu erau grupate în mutanții Shhcre;Robo (Fig. 2, C și D). Acest fenotip foarte penetrant a persistat în plămânii postnatali (Fig. 2, E și F, și fig. S7). Numărul total de celule PNEC pare să nu fie afectat, după cum susține expresia normală a Ascl1 și a altor markeri PNEC (fig. S8). Celulele neaglomerate din mutant își pierd forma de pană și sunt mai rotunjite (fig. S7 și S9). Mai mult, spre deosebire de martori, unde PNEC solitare nu sunt inervate (9), ~33,3% (31 din 93 de celule) din PNEC neaglomerate sunt inervate în mutant (fig. 2F și fig. S9), ceea ce sugerează că inervația PNEC nu depinde de formarea de clustere sau de funcția Robo în PNECs.

Mutanții Ascl1creERT2;Robo prezintă, de asemenea, dezaglomerarea PNEC (fig. S10). Acest fenotip s-a manifestat chiar și atunci când inactivarea Robo a fost indusă postnatal, care este ulterioară formării NEB. Împreună, rezultatele noastre stabilesc că Robo este necesar pentru asamblarea și menținerea PNEC în NEB.

Robo poate funcționa fie în mod dependent, fie independent de ligandul său, Slit (18). Analiza mutanților Slit arată că, în timp ce gruparea PNEC nu este afectată în niciunul dintre mutanții individuali, aceasta este redusă în mutanții Slit1;3 (fig. S11, A-D). Acest rezultat sugerează că funcția Robo în acest proces este probabil dependentă de ligand.

Slit și Robo funcționează în principal pentru a media repulsia celulară și rareori atracția (19). Pentru a determina dacă Slit acționează ca un semnal de respingere sau de atracție pentru PNEC-urile care exprimă Robo, am determinat mai întâi unde sunt exprimate genele Slit. Reporterul combinat Slit1;2-GFP (proteină fluorescentă verde) a dezvăluit expresia doar în aproximativ 1 până la 3 PNEC-uri în cadrul unor NEB-uri mari, ridicând posibilitatea ca celulele care exprimă Slit1/2 să fie celulele nucleatoare ale clusterului (fig. S11E). Acest lucru indică, de asemenea, subspecializarea PNEC în cadrul unui cluster. Expresia Slit3 este limitată la stratul de celule musculare netede vasculare care înconjoară arterele, care se desfășoară de-a lungul bronhiilor principale, unde se găsesc cele mai multe NEB (fig. S11, F și G). Împreună, proximitatea strânsă a celulelor care exprimă Slit față de PNEC care exprimă Robo a ridicat posibilitatea ca liganzii Slit să ofere un indiciu atractiv pentru PNEC.

Pentru a testa acest lucru, PNEC GAD1-GFP+ sortate prin citometrie de flux au fost însămânțate în camera superioară a unei inserții de cultură pentru migrația celulelor Boyden. Atunci când proteina Slit a fost adăugată împreună cu celulele din camera superioară, ~52% mai puține PNEC-uri (P = 8,5 × 10-4) au migrat spre partea inferioară (fig. S12, J – I). În schimb, atunci când proteina Slit a fost adăugată în camera de jos, cu 18% mai multe (P = 7,5 × 10-5) PNEC au migrat spre partea de jos (fig. S11, de la L la N). Aceste rezultate sugerează că Slit-Robo determină gruparea PNEC în NEB, probabil prin atracție celulară.

Pentru a testa o posibilă legătură între PNEC și răspunsul imunitar, am testat expresia neuropeptidelor produse de PNEC (1). Dintre cele nouă gene de neuropeptide testate, cinci au fost semnificativ reglate în sus în mutanții Shhcre;Robo (Fig. 3A). Colorarea cu anticorp împotriva CGRP a arătat că, deși expresia sa rămâne în PNEC-urile mutante, intensitatea colorării este crescută și nu mai este limitată la partea bazală a acestor celule (fig. S7 și S9). De asemenea, observăm că, în timp ce dezaglomerarea a avut loc până la E15,5, creșterea neuropeptidelor este observată numai după naștere, probabil în urma expunerii la aer (fig. S12).

Pentru a determina dacă creșterea neuropeptidelor contribuie la răspunsul imunitar, ne-am concentrat asupra CGRP, deoarece transcripția sa prezintă cea mai mare creștere dintre toate cele analizate (fig. 3A). Am contracarat această creștere prin reproducerea unei alele mutante de Cgrp în fondul Shhcre;Robo (20). În controalele Robo, pierderea Cgrp nu a modificat numărul de macrofage (Fig. 3, B, D și F). Cu toate acestea, la mutanții Shhcre;Robo, pierderea Cgrp a scăzut semnificativ numărul de macrofage într-o manieră dependentă de doză (Fig. 3, C, E și F). Am constatat, de asemenea, că pierderea Cgrp a inversat parțial fenotipul simplificării alveolare (fig. S13). Observăm că nici creșterea macrofagelor și nici simplificarea alveolară nu au fost împiedicate în întregime, sugerând că creșterea altor neuropeptide poate adăuga la rezultatele din aval. Împreună, aceste rezultate oferă o demonstrație genetică in vivo a faptului că neuropeptidele mediază funcția PNEC.

Acum alveologeneza normală se inițiază la P4 (21), apariția târzie a simplificării alveolare la P15 sugerează că întreruperea alveologenezei poate să nu fie o cauză primară. Deși nu s-a observat nicio modificare a morții celulare până la P10, a existat o reducere clară a elastinei (fig. S14), care este un posibil declanșator al simplificării (22). Celulele imune, cum ar fi macrofagele, exprimă metaloproteinaze de matrice care degradează elastina (23). Mai mult, creșterea numărului de macrofage este observată înainte de simplificare (fig. S1 și S2), ceea ce ridică posibilitatea unei relații de cauzalitate. Pentru a testa acest lucru, am tratat plămânii Shhcre;Robo și de control cu clodronat, un medicament hidrofil care epuizează macrofagele (24). Tratamentul care a început la P5, înainte de creșterea celulelor imune, a restrâns în mod eficient numărul de macrofage alveolare la nivelul de bază la mutanții Shhcre;Robo (Fig. 4, de la A la E). Acest lucru a atenuat scăderea elastinei și a împiedicat în întregime simplificarea (Fig. 4, de la F la J, și fig. S15). Împreună, aceste date oferă o demonstrație in vivo că infiltratele imune crescute sunt responsabile de simplificarea alveolară și că ambele sunt consecințe în aval ale disfuncției PNEC.

În acest studiu, prezentăm dovezi genetice in vivo care demonstrează că PNEC, în ciuda rarității lor, au un impact profund asupra funcției pulmonare postnatale. Deși defectul PNEC este deja evident la E15,5 la mutantul Shhcre;Robo, rezultatele fiziologice, începând cu reglarea ascendentă a neuropeptidelor, se inițiază după naștere. Acest lucru sugerează că efectul PNEC este dependent de expunerea plămânilor la aer. Astfel, constatările noastre delimitează un mod de transducție a semnalului în care PNEC sunt reostate sensibile pe peretele căilor respiratorii care traduc indicii de mediu în mod neautonom celular în răspunsuri imune.

Rezultatele noastre stabilesc Robo1,2 ca fiind un set de gene care controlează gruparea PNEC în NEB. De asemenea, prezintă Slit și Robo ca jucători în sortarea selectivă a celulelor în epiteliul unui organ de mamifere. Inactivarea lui Robo după formarea NEB a dus, de asemenea, la dezaglomerare, sugerând că grupurile sunt menținute în mod activ. Deși Slit-Robo sunt în mare parte cunoscute pentru a media repulsia celulară, datele noastre indică faptul că acestea conduc gruparea PNEC prin atracție celulară. Inactivarea Robo a dus la alterarea inervației și la pierderea localizării orientate spre bazal a neuropeptidelor. Aceste modificări pot sta la baza impactului modificat în aval al PNEC-urilor.

O creștere a numărului de PNEC-uri a fost documentată într-o gamă largă de boli asociate plămânilor, de la tulburări rare, cum ar fi CDH, la afecțiuni comune, cum ar fi astmul (5-8). Observăm că fenotipul PNEC mutant Robo este distinct de creșterea numărului de PNEC. Cu toate acestea, ambele sunt asociate cu o creștere a neuropeptidelor, despre care noi arătăm că sunt efectoare puternice ale funcției PNEC. Descoperirile noastre prezic astfel că, mai degrabă decât să fie o citire pasivă a bolii, patologiile PNEC documentate și creșterile neuropeptidelor pot servi drept contribuitori activi la simptome într-o gamă largă de boli respiratorii.

.