„O tehnică genetică moleculară utilizată pentru manipularea, alterarea sau modificarea directă a genelor sau a genomului organismelor în vederea manipulării fenotipurilor se numește inginerie genetică.”

Sau, cu alte cuvinte, putem spune:

„Ingineria genetică este o tehnică prin care poate fi modificată compoziția genetică a unui organism.”

Tehnica este deseori cunoscută sub numele de manipulare genetică, modificare genetică sau alterare genetică, în sens larg este clasificată ca inginerie genetică.

În această tehnică, un ADN recombinant este construit și inserat în genomul gazdei cu ajutorul unui vector. Sau putem șterge unele secvențe mutante dintr-un genom. Primul ADN recombinant a fost construit de Paul Berg în 1972.

Utilizând tehnica ingineriei genetice pot fi construite organisme modificate genetic care sunt foarte importante pentru noi din punct de vedere economic.

Este folosită pentru producerea de specii de plante îmbunătățite, medicamente sau proteine terapeutice, prevenirea tulburărilor genetice moștenite și construirea unui organism modificat genetic.

În articolul de față, vom vorbi în principal despre ingineria genetică și aplicațiile sale. Conținutul articolului este,

• Ce este ingineria genetică
  • Definiție
  • Istorie
  • Tipuri
  • Proces

.

• Aplicații ale ingineriei genetice
• Limitări ale ingineriei genetice
• Concluzie

Omul manipulează de mult timp materialul genetic al multor organisme. Folosind reproducerea selectivă și hibridizarea încrucișată, au fost create de noi specii de plante importante din punct de vedere economic.

Scopul dezvoltării ingineriei genetice sau a tehnicii de manipulare genetică este acela de a produce organisme sau fenotipuri care să ne fie utile. Tehnicile de inginerie genetică sunt utilizate pentru,

• Construirea de specii de plante modificate genetic.
• Specii de plante rezistente la stres antibiotic și biotic.
• Specii de plante importante din punct de vedere economic
• Organisme valoroase din punct de vedere comercial
• Pentru producerea de medicamente terapeutice
• Prevenirea anomaliilor genetice.

„În ingineria genetică, ADN-ul a două celule diferite este combinat și inserat în genomul gazdei prin intermediul unui vector.” Componentele importante ale experimentelor de manipulare genetică sunt explicate aici.

Gena de interes: O secvență de ADN pe care dorim să o inserăm în celulele țintă.

Vector: folosind vectorii de genul ADN plasmidic, gena de interes este inserată în genomul gazdei. Vectorii sunt un fel de vehicule care transferă materialul genetic.

Celule țintă: celulele țintă sunt populația de celule al căror genom dorim să îl manipulăm sau să îl modificăm.

Definiții:

„O tehnică folosită pentru a insera sau șterge o genă mutantă sau pentru a manipula genomul unui organism este cunoscută sub numele de inginerie genetică.”

Istoria ingineriei genetice:

Termenul inginerie genetică a fost folosit pentru prima dată de romancierul de science-fiction, nu de vreun om de știință. În anul, 1951, Jack Williamson a folosit pentru prima dată termenul „inginerie genetică” în romanul său „Insula dragonului”.

La scurt timp după aceea, structura moleculară a ADN-ului a fost descoperită de Watson și Crick, deși experimentele genetice erau populare încă de pe vremea lui Mendel.

Primul ADN recombinant a fost construit de Paul Berg în 1972. În același an, Herbert Boyer și Stanley Cohen au efectuat experimente de transfer de gene. În 1974, Rudolf Jaenisch a creat șoareci modificați genetic, pentru prima dată în istoria geneticii.

După succesul lui Rudolf, în 1976 a fost dezvoltată specia de plantă de tutun modificată genetic sau modificată genetic.

În această perioadă (între 1960 și 1990) au fost descoperite tehnici asemănătoare digestiei de restricție, ligării și PCR care au dat aripi tehnologiei de inginerie genetică.

Articol conex: Ce este un genom?

Tip de tehnici de inginerie genetică:

ADN recombinant- O tehnologie de recombinare a ADN-ului este un tip de tehnologie de inginerie genetică în care o moleculă artificială de ADN este construită prin ligatura a două ADN-uri diferite folosind metode fizice. Pentru aceasta, gena de interes este inserată în vectorul plasmidic și utilizată pentru experimente de transfer de gene.

Transmiterea genei- Tehnica de transmitere a genei este utilizată pentru inserarea unei gene de interes în genomul gazdei.

Transferul de gene mediat prin electroflorare, solicitare și vector viral, transferul de gene mediat de lipozomi, transferul de gene mediat de transpozoni sunt câteva dintre metodele utilizate în acest scop.

Editarea genelor- O tehnică de editare a genelor este utilizată pentru a edita genomul în care o secvență nedorită de ADN este eliminată sau o nouă genă poate fi inserată în genomul gazdei. CRISPR-CAS9, TALEN și ZFN sunt câteva instrumente cunoscute de editare a genelor utilizate în experimentele de terapie genică.

Citește mai mult: Ce este editarea genelor și CRISPR-CAS9?

Procesul de inginerie genetică:

Tehnica de inginerie genetică este utilizată în mai multe scopuri diferite, astfel că trebuie să decidem mai întâi scopul experimentului. Întregul proces de inginerie genetică poate fi împărțit în 5 etape mai ample:

• Selectarea și izolarea genei candidate
• Selectarea și construirea plasmidului
• Transformarea genei
• Inserția ADN-ului în genomul gazdei
• Confirmarea inserției

Selectarea și izolarea genei candidate:

Gena trebuie să conțină o secvență de ADN pe care dorim să o studiem și, pentru aceasta, o genă are unele caracteristici speciale. O genă candidată trebuie să aibă un conținut ridicat de GC și o secvență de ADN repetitivă mai mică.

În plus, gena de interes nu trebuie să fie prea lungă – doar câteva gene de câțiva kb pot fi inserate cu succes. Cu cât mai lungă este gena, cu atât mai mare este șansa de eșec. Gena candidată trebuie să aibă în ea un codon de start și unul de stop. Articol conex: Ce este codul genetic?

Acum, gena de interes poate fi izolată de restul ADN-ului folosind fie digestia de restricție, fie reacția în lanț a polimerazei.

Endonucleazele de restricție sunt enzimele bacteriene care au puterea de a digera secvența de ADN într-un anumit loc. Folosind un tip specific de endonuclee de restricție putem tăia și izola gena noastră de interes.

Metoda de digestie de restricție este explicată în articolul nostru anterior: Ce este digestia de restricție?

În reacția în lanț a polimerazei, folosind informațiile din secvența genei, gena de interes sau gena candidată este amplificată în termociclator.

Mașina, folosind reacția în lanț a polimerazei face milioane de copii ale unei gene de interes pentru noi. Prin procesul de electroforeză pe gel de agaroză, gena amplificată este izolată.

Dacă gena de interes este bine studiată, anterior, atunci informația unei gene este accesibilă în biblioteca genetică și o putem folosi pentru sinteza artificială a unei gene de interes pentru noi. (folosind informațiile din biblioteca genetică, gena poate fi, de asemenea, sintetizată artificial)

În etapa următoare, efectuați purificarea ADN-ului, dacă este necesar. Acum ADN-ul nostru este gata să fie inserat într-o plasmidă.

Selectarea și construirea plasmidului:

Selectarea plasmidului pentru experimentul de inginerie genetică este una dintre etapele cruciale din întregul experiment. Înainte de a selecta plasmidul, trebuie să înțelegem de ce este utilizat plasmidul în experimentele de transfer de gene.

ADN-ul plasmidic este un ADN citoplasmatic circular, bicatenar, al bacteriilor care se replică independent.

Cercetătorii îl folosesc ca vehicul pentru a transfera gena de interes în locația țintă din genom. Acesta poate transfera eficient gena la locația țintă. Structura plasmidului este explicată în figura de mai jos,

Articol conex: Ce este o plasmidă?

Prepararea plasmidelor:

Selectați plasmidul care se potrivește experimentului dumneavoastră.

Plasmidul trebuie să aibă originea de replicare, regiunea promotoare, gena de rezistență la antibiotice și alte secvențe importante. Utilizând metoda digestiei de restricție, se introduce în plasmidă un situs de inserție la care se lighează gena noastră de interes.

Utilizând ADN ligazele T4 ca și sigilatorul de putere, ADN-ul de interes pentru noi este inserat și ligat în plasmidă. Împreună cu plasmidul, în ADN-ul plasmidic se introduce și un marker selectabil pentru a identifica ADN-ul recombinat.

În plus, o regiune promotoare și secvențe terminatoare sunt, de asemenea, incluse în plasmidă pentru exprimarea eficientă a unei gene de interes pentru noi. O plasmidă cu gena noastră de interes și alte câteva secvențe importante este acum denumită moleculă de ADN recombinat.

Acum ADN-ul nostru recombinant este gata pentru exprimare.

Dacă efectuăm clonarea genei, plasmidul este inserat în gazda bacteriană, pentru aceasta, în general, se utilizează în mod obișnuit E.Coli. Odată ce bacteria începe să se dividă, ADN-ul nostru plasmidic recombinant este, de asemenea, replicat împreună cu ea.

Acum avem mai multe copii ale ADN-ului nostru plasmidic care sunt extrase cu ajutorul kitului de extracție a ADN-ului plasmidic și utilizate pentru experimentele de transformare.

Transformarea în genomul gazdei:

Transportul ADN-ului recombinant în celula receptoare sau în genomul gazdă este o altă sarcină anevoioasă și dificilă. Diferite metode de inserție a ADN-ului recombinant sunt utilizate pentru diferite tipuri de celule, deoarece o singură metodă nu poate fi utilizată pentru toate tipurile de celule.

Diverse metode de transformare:

Utilizarea stresului- bacteriile asimilează cu ușurință ADN-ul plasmidic folosind anumiți factori de stres, cum ar fi căldura sau șocul electric.

Microinjecție- se utilizează un ac ascuțit pentru inserarea ADN-ului direct în nucleul unei celule, însă metoda este mai puțin eficientă și necesită un nivel mai ridicat de expertiză pentru aceasta.

Electroporare- una dintre cele mai bune metode care are o rată mare de succes este metoda de electroforare, în care ADN-ul recombinant este inserat în genomul gazdei prin permeabilizarea celulei cu curent electric.

Am abordat un întreg articol pe această temă. Citiți-l aici: Electroporation- A Modern Gene Transfer Technique.

Sonicare- sonicare este încă o metodă bună folosită uneori în experimentul de transfer de gene în care ADN-ul recombinant este inserat în celula țintă cu ajutorul undelor ultrasonice. Undele ultrasonice cresc, de asemenea, permeabilitatea celulelor.

Transferul de gene mediat de lipozomi- Folosind un înveliș exterior artificial asemănător unei celule, cunoscut sub numele de lipozom- ADN recombinant poate fi inserat în genomul gazdei.

Transferul de gene prin infecție bacteriană- Această metodă este una dintre metodele populare și este utilizată în mod curent în experimentele de inginerie genetică a plantelor. Aici, specia vegetală este infectată cu bacterii transformate pentru a insera o genă de interes.

Agrobacterium tumifecian este utilizat pentru a insera ADN recombinant în celula vegetală. O genă de interes este inserată în plasmidul Ti- din Agrobacterium. Celulele vegetale sunt infectate de această cultură celulară bacteriană, iar celulele transformate sunt regenerate folosind metodele de cultivare a țesuturilor vegetale.

Chimice în transferul de gene- În experimentele de transfer de gene se folosesc, de asemenea, unii ioni metalici, substanțe chimice și soluții de diferite substanțe chimice, însă rata de succes este prea mică în comparație cu celelalte metode.

Confirmarea inserției:

Lucrarea noastră nu este încă finalizată.

Acum trebuie să ne conformăm, dacă ADN-ul recombinant este inserat în celula noastră țintă sau nu. Pentru aceasta se folosesc diverse tehnologii de genetică moleculară. În metoda tradițională de cultivare, prezența sau absența unui marker selectabil este utilizată pentru a diferenția celulele transformate de cele netransformate.

Deși, nu este necesar pentru metoda de detecție bazată pe PCR. Metoda de detecție bazată pe reacția în lanț a polimerazei este acceptată pe scară largă, mai de încredere decât alte metode.

ADN-ul este extras din celula transformată și amplificat cu ajutorul amorselor complementare genei noastre de interes sau ADN-ului nostru recombinant.

Dacă ADN-ul recombinant este prezent, acesta este cu siguranță amplificat, altfel nu se obține nicio amplificare. Pentru conformația cu doi factori, se ia un set de amorsă complementară ADN-ului recombinant specific și un set de amorsă complementară secvenței markerului selectabil și se efectuează PCR multiplex.

Pentru validarea rezultatelor, trebuie să se obțină amplificare în ambele reacții.

Dar stați puțin!

Ce s-a întâmplat dacă în timpul experimentului a apărut vreo mutație în gena noastră de interes? Pentru că PCR nu poate amplifica decât ADN-ul. Trebuie să avem nevoie de informații despre secvență pentru a detecta mutația.

Pentru aceasta, se folosește metoda de secvențiere a ADN-ului.

ADN-ul este extras din celulele transformate și gena de interes este amplificată cu ajutorul PCR. Acum, ampliconii PCR sunt folosiți pentru secvențierea ADN-ului în care, folosind chimia fluorescentă, se determină în mod ordonat secvența genei noastre de interes.

După ce toți parametrii pentru determinarea genei de interes au fost îndepliniți, celulele noastre sunt acum pregătite pentru a fi injectate în organismul gazdă sau pentru experimente de cultură de țesuturi.

Aplicații ale ingineriei genetice:

Acum ajungem la punctul important al acestui subiect, „La ce se folosește ingineria genetică?”

Ingineria genetică are o mare valoare industrială și agricolă. Ea este practicată în medicină, în cercetarea genetică, în agricultură, în ameliorarea culturilor și pentru producerea de medicamente terapeutice.

Se utilizează, de asemenea, în dezvoltarea organismelor modificate genetic. În cele ce urmează discutăm câteva dintre aplicațiile importante ale ingineriei genetice.

Tehnologia ADN recombinant este utilizată în ameliorarea culturilor și în dezvoltarea de noi trăsături importante din punct de vedere economic. Unele dintre acestea sunt:

• Rezistența la erbicide
• Rezistența la viruși
• Maturarea întârziată a fructelor
• Conținut modificat de ulei
• Controlul polenului
• Dezvoltarea unor specii de plante tolerante la frig și la secetă.

Un exemplu clasic este bumbacul BT- unul dintre tipurile de specii modificate genetic asigură rezistența plantei la bacillus thuringiensis.

Procesul de dezvoltare a speciilor de plante modificate genetic:

O genă de interes este izolată din organism cu ajutorul digestiei de restricție sau amplificată prin reacția în lanț a polimerazei. ADN recombinat se construiește prin inserția unei gene de interes în plasmidă, aici se folosește plasmidul T-.

În etapa următoare, plasmidul T- este inserat în agrobacterium. În ultima etapă, specia vegetală este infectată cu celulele bacteriene transformate și cultivată. Întregul proces este prezentat în figura de mai jos,

GMF- alimentele modificate genetic reprezintă o altă aplicație optimă a ingineriei genetice, în care produsele alimentare importante din punct de vedere economic sunt construite cu ajutorul tehnologiei ADN recombinant.

Exemplul clasic este roșia Flavr Savr, o specie de tomate modificată genetic constituită prin tehnologia ARN antisens. Aceasta are mari valori economice, deoarece roșia modificată genetic poate fi ușor transportată dintr-un loc în altul.

O altă aplicație importantă a ingineriei genetice este reprezentată de alimentele modificate genetic sau modificate genetic.

Calitatea unora dintre produsele alimentare, cum ar fi bumbacul, porumbul și soia, este îmbunătățită cu ajutorul tehnologiei actuale a ADN-ului recombinant. Scopul dezvoltării culturilor sau a speciilor de plante modificate genetic este de a le face importante din punct de vedere economic, nutritive, bogate în proteine, rezistente la boli și la stres.

Inclusiv cu ajutorul tehnicilor de inginerie genetică și a tehnicilor de cultură de țesuturi sunt dezvoltate specii de plante rezistente la insecticide în tutun, cartof, porumb și bumbac.

În plus, cu ajutorul prezentei tehnici de modificare genetică pot fi create și unele plante modificate capabile să își genereze propriile îngrășăminte.

Organismele model transgenice sunt dezvoltate pentru a testa diferiți parametri – funcția anumitor gene poate fi determinată prin proiectarea microorganismului transgenic și a modelelor animale.

Microorganismele modificate genetic care sunt capabile să degradeze substanțele toxice pot fi distruse cu ajutorul agenților patogeni dăunători și al pastelor insecticide.

Aplicații medicinale:

Medicamentele, hormonii, enzimele și vaccinurile cu costuri reduse sunt create cu ajutorul instrumentelor de inginerie genetică.

Factorul anti-coagulare a sângelui este cel mai bun exemplu în care enzima de activare a plasminogenului, care este capabilă să dizolve cheagul de sânge, este concepută în mod artificial și utilizată la pacienții cu boală coronariană sau atac de cord.

Alte exemple sunt alte două proteine terapeutice somatostatina și limfokinele care acționează împotriva mai multor afecțiuni și care pot fi sintetizate artificial. Insulina este încă un exemplu clasic de proteină terapeutică concepută cu ajutorul tehnologiei de inginerie genetică.

Se izolează o genă pentru insulină prin digestie de restricție sau prin PCR și se inserează în plasmidă. ADN-ul plasmidic recombinant este inserat imediat în celula bacteriană sau de drojdie în care se înmulțește plasmidul. Pe măsură ce microorganismul începe să se dividă, acesta începe să producă insulină artificială.

O cantitate mare de insulină produsă folosind aceeași tehnică la scară industrială. Schema detaliată a producției de insulină este prezentată în figura de mai jos,

Producția comercială de insulină a început după aprobarea FDA în 1982.

Vaccinuri recombinate:

Vaccinurile împotriva variolei, a virusului herpes simplex și a hepatitei sunt produse folosind tehnica ingineriei genetice. Vaccinurile sunt particule virale inactivate utilizate pentru a induce un răspuns imunitar împotriva agentului patogen respectiv, însă șansele de contaminare sunt mari în cadrul acestuia.

Utilizând tehnologia ADN-ului recombinant, oamenii de știință au creat un tip unic de vaccinuri care conține doar ADN-ul pentru proteina de acoperire virală, astfel că agentul patogen nu mai poate fi activat niciodată. Principalul avantaj al acestuia este că este mai sigur, fără contaminare și mai reactiv.

Inginerie genetică în terapia genică:

Utilizând terapia genică sau tehnica de transfer de gene, pot fi vindecate tulburările genetice moștenite. Terapiile genetice asemănătoare fibrozei chistice, distrofiei musculare Duchenne și anemiei celulelor secerătoare se află acum în faza finală de testare clinică și sunt gata să fie utilizate pe pacienți.

În terapia genică, o genă defectă, nefuncțională sau mutantă este înlocuită cu una de tip sălbatic folosind aceeași tehnică explicată mai sus.

Am acoperit articole uimitoare despre terapia genică, citiți-le aici:

1. Terapia genică: Tipuri, vectori , proces, aplicații și limitări.
2. Ce este terapia genică? și cum funcționează?
3. Terapie genică mediată de ADN nedezvăluit
4. Sistemul de transpozoni Sleeping Beauty: Viitorul terapiei genice

În plus, tehnologia ingineriei genetice este, de asemenea, utilizată în producția de biocombustibil, boli, bioalcool și alte produse esențiale.

Limitări ale ingineriei genetice:

Există probleme etice asociate cu utilizarea terapiei genetice și a produselor obținute prin inginerie genetică.

De asemenea, pentru a oferi o valoare economică produsului alimentar sau oricărui produs modificat genetic, valorile nutriționale sunt compromise.

Din cauza efectului advers al acesteia, noi tulpini patogene rezistente evoluează mai rapid.

De asemenea, efectele secundare ale terapiei genice și utilizarea virușilor în cadrul acesteia sunt dăunătoare pentru organismul țintă.

Tehnologia este mai costisitoare, deoarece terapia genică costă până la 50.000 USD.

Concluzie:

Jucarea cu embrionul sau fătul este împotriva legii naturale, oamenii cred cu tărie în ea, astfel că alimentele și produsele vegetale modificate genetic devin mereu un centru de controversă.

Cu toate acestea, folosind instrumente de inginerie genetică, cum ar fi terapia genică și tehnica de transfer de gene, pot fi prevenite tulburările moștenite și cancerul ca și bolile letale. Utilizarea pozitivă a tehnicilor de inginerie genetică poate schimba soarta omenirii.

Surse:

1. National Research Council (US) Committee on Identifying and Assessing Unintended Effects of Genetically Engineered Foods on Human Health. Safety of Genetically Engineered Foods (Siguranța alimentelor modificate genetic): Approaches to Assessing Unintended Health Effects. Washington (DC): National Academies Press (SUA); 2004. 2, Methods and Mechanisms for Genetic Manipulation of Plants, Animals, and Microorganisms (Metode și mecanisme de manipulare genetică a plantelor, animalelor și microorganismelor).
2. Wallace RB. Principii de manipulare genetică. O introducere în ingineria genetică. Studii de microbiologie. Am J Hum Genet. 1981;33(4):652-653.