Material vegetal

Frunzele de Strychnos spinosa Lam. au fost colectate în ianuarie 2013 din satul Sakara, Zaria, Nigeria. Materialul vegetal a fost identificat de către Musa Muhammad, un botanist din secția de ierbar a Departamentului de Științe Biologice (Universitatea Ahmadu Bello, Zaria), unde a fost depus un exemplar voucher (nr. 900161). Frunzele colectate au fost uscate într-o încăpere ventilată, ferită de contaminare, apoi au fost măcinate până la obținerea unei pulberi cu ajutorul unei mori Macsalab (Model 2000 LAB Eriez), păstrate într-un recipient de sticlă și depozitate la întuneric la temperatura camerei (25 ± 3°C) înainte de utilizare.

Extracție și fracționare lichid-lichid

Extracții cu acetonă, metanol și diclorometan/metanol

O variație a metodei lui Suffness & Douros a fost utilizată pentru a fracționa componentele prezente în diferite extracte din frunze. Pulberea de frunze uscate (2 kg) a fost macerată de trei ori în acetonă (6 l) pentru a obține extractul de acetonă (AcetE, 75 g) după filtrare și îndepărtarea solventului în vid. Reziduurile au fost macerate în continuare în metanol (6 l), urmând aceeași procedură ca cea descrisă mai sus pentru extracția cu acetonă, pentru a obține extractul de metanol (MetE, 119,2 g). O parte din frunzele uscate sub formă de pulbere (1 kg) a fost, de asemenea, extrasă într-un amestec (1/1, v/v) de diclorometan/metanol (3 l) de trei ori pentru a obține extractul de diclorometan/metanol (DcmMetE, 114 g) după filtrare și îndepărtarea solventului în vid. O parte din extractul de acetonă (70 g) a fost dizolvată și fracționată într-un amestec (1/1, v/v) de cloroform și apă pentru a obține fracțiile de apă și cloroform. n-butanol a fost adăugat la fracția de apă pentru a obține fracțiile de n-butanol (nButF, 25,1 g) și apă (Wat1, 5 g). Fracția de cloroform a fost concentrată până la uscare și dizolvată în 10% apă în metanol înainte de extracția cu hexan. Prin urmare, fracția hexanică (HexF, 23,9 g) și reziduul de 10% apă în metanol au fost obținute după adăugarea de n-hexan. Proporția de apă în metanol a fost crescută pentru a obține o componentă de 35% apă în metanol, care a dat în final fracții de cloroform (ChlF, 7,05 g) și 35% apă (wat2, 2,8 g) după adăugarea de cloroform. Din TLC-ul comparativ, fracțiile de apă (Wat1) și 35% apă în metanol (Wat2) au fost combinate într-o singură fracție (WatF, 7,8 g).

Extragerea alcaloizilor

Frunzele de S. spinosa (1 kg) au fost macerate cu amestecul (96:3:1, v/v) de EtOAc-EtOH-NH4OH (600 ml) și apoi percolate cu EtOAc pentru a obține extractul (26 g) după îndepărtarea solventului cu ajutorul unui evaporator rotativ sub presiune redusă. Extractul a fost dizolvat în EtOAc și extras cu acid acetic 4% pentru a obține fracția EtOAc (EtAcF, 20,02 g). Soluția acidă (pH 3-4) a fost badificată la pH (8-9) cu Na2CO3 și extrasă de trei ori cu DCM pentru a obține extractul brut de alcaloizi (AlkE, 2,8 g) după îndepărtarea solventului în vid.

Analiză antimicrobiană

Microorganisme și pregătirea inoculului

Microorganismele utilizate au fost trei bacterii Gram-pozitive, Bacillius cereus (ATCC 14579), Staphylococcus aureus (ATCC 29213) și Enterococcus faecalis (ATCC 29212), o bacterie Gram-negativă, Escherichia coli (ATCC 25922); și patru ciuperci, inclusiv trei drojdii Candida albicans, Cryptococcus neoformans (izolate de animale) și Candida albicans (ATCC 10231) și o ciupercă filamentoasă Aspergillus fumigatus. Unele tulpini fungice utilizate au fost cultivate din cazuri clinice de boli infecțioase fungice la animale, înainte de tratament, în cadrul Departamentului de Boli Tropicale Veterinare, Facultatea de Științe Veterinare. C. albicans a fost izolat de la un finch gouldian, C. neoformans de la un ghepard, în timp ce A. fumigatus a fost izolat de la un pui care suferea de o micoză sistemică.

Culturile de bacterii și ciuperci au fost prelevate din plăci de cultură în agar proaspăt de 24 h și inoculate în bulion proaspăt de dextroză Sabouraud (SDB) pentru ciuperci și în bulion Mueller-Hinton (MHB) (Fluka, Elveția) pentru bacterii, înainte de efectuarea testului. Turbiditatea suspensiei microbiene a fost ajustată la un standard McFarland 0,5, echivalent cu concentrații de 1-5 × 108 și 1-5 × 107 ufc/ml pentru bacterii și, respectiv, ciuperci. Suspensiile microbiene au fost diluate în continuare (1:100) în mediu pentru a obține un inocul final de aproximativ 1,5 × 106 ufc/ml pentru bacterii și 1,5 × 105 ufc/ml pentru ciuperci.

Determinarea concentrației minime inhibitoare

Pentru determinarea valorilor concentrației minime inhibitoare (CMI) pentru extracte și fracțiuni împotriva bacteriilor și ciupercilor s-a folosit o metodă de microdiluție în serie de două ori cu violet de tetrazoliu ca indicator al creșterii microbiene, modificată de Masoko et al. .

A 100 μl (10 mg/ml) de extracte și fracțiuni dizolvate în dimetilsulfoxid (DMSO) au fost diluate în serie de două ori cu apă distilată sterilă în plăci de microtitrare cu 96 de godeuri și 100 μl de cultură microbiană proaspăt preparată în MHB sau SDB au fost adăugate în fiecare gode. DMSO (5 %) a fost utilizat ca martor negativ, în timp ce gentamicina (1 mg/ml) și amfotericina B au fost martori pozitivi. Plăcile de microtitrare au fost închise în pungi de plastic și incubate timp de 24 de ore la 37°C. Ulterior, 40 μl de 0,2 mg/ml de violet de p-iodonitrotetrazoliu (INT) au fost adăugați în fiecare fântână și plăcile de microtitrare au fost incubate în continuare la 37°C. Concentrațiile minime inhibitorii au fost determinate după 1 și 2 h pentru bacterii și după 16 și 36 h pentru ciuperci. CMI a fost determinată ca fiind cea mai mică concentrație care inhibă creșterea microbiană, indicată de o scădere a intensității culorii roșii a formazanului.

Analize antioxidante

Activitățile antioxidante ale extractelor și fracțiunilor din frunzele de S. spinosa au fost determinate în ceea ce privește capacitatea de captare a radicalilor liberi folosind 2,2′-difenil-1-picrihidrazil (DPPH) și 2,2-azino-bis (acidul 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic) sare de diamoniu (ABTS).

Starea DPPH

Activitatea antioxidantă a fost realizată așa cum a fost descrisă de Du Toit et al. cu mici modificări. Probele au fost dizolvate în metanol de calitate HPLC (Sigma-Aldrich, Germania) și diluate de două ori în serie până la intervale de concentrație cuprinse între 1 000 și 7,81 μg/ml pentru extracte și fracțiuni și între 40 și 0,31 μg/ml pentru o referință standard de acid L-ascorbic (Sigma, Germania). Pe scurt, 40 μl de (10 mg/ml) de probe au fost introduse într-o placă de microtitrare cu 96 de godeuri (Bioster, Spania) și diluate de două ori în serie în metanol. Ulterior, 160 μl de (3,7 mg/100 ml) soluție metanolică de 2,2-difenil-1-picrihidrazil (DPPH) au fost introduse în fiecare gode și, după 30 de minute de incubare la temperatura camerei, la întuneric, iar absorbția a fost măsurată la 517 nm cu ajutorul unui cititor de microplăci multimodal (BioTek, SUA). Activitatea de captare a radicalilor liberi a fiecărei probe și a etalonului de referință au fost determinate ca procent de inhibiție obținut prin următoarea formulă:

Cu Absample ca absorbanța extractului cu DPPH, Abblank ca absorbanța extractului fără DPPH și Abcontrol ca absorbanța de metanol și DPPH. Concentrația probelor care reduce 50% din radicalii liberi DPPH (IC50) a fost determinată prin reprezentarea grafică a procentului de inhibiție în raport cu concentrațiile probelor. Testul a fost repetat de trei ori, iar rezultatele sunt exprimate ca medie ± abatere standard.

Testul ABTS

Capacitatea de captare a radicalilor ABTS a extractelor și fracțiunilor a fost determinată folosind o metodă a lui Re et al. cu ușoare modificări. Pe scurt, radicalul ABTS a fost generat prin reacția dintre o soluție de 7 mM de ABTS și o soluție de 2,45 mM de persulfat de potasiu la temperatura camerei timp de 12 h. Absorbția soluției stoc de radical ABTS a fost ajustată la 7,00 ± 0,02 la 734 nm înainte de utilizare. 40 μl dintr-o soluție de extracte sau fracțiuni dizolvate în metanol de calitate HPLC (Sigma-Aldrich, Germania) au fost introduse în plăci de microtitrare și diluate în serie de două ori până la concentrații cuprinse între 15,62 și 2000 μg/ml. Trolox (Sigma, Germania) și acidul L-ascorbic (Sigma, Germania) au fost preparate în concentrații cuprinse între 200 și 1,56 μg/ml. Ulterior, 160 μl de soluție ABTS au fost adăugate în godeuri (cu excepția blancului), iar absorbția a fost măsurată la 734 nm după 6 minute de incubare la temperatura camerei. Troloxul și acidul ascorbic au fost utilizate ca martori pozitivi, metanolul ca martor negativ și extractele sau fracțiunile fără ABTS ca martor alb. Procentul de inhibiție ABTS-+ și IC50 au fost calculate așa cum au fost raportate mai sus pentru testul DPPH.

Test de citotoxicitate

Citotoxicitatea extractelor de acetonă și a fracțiunilor împotriva celulelor de rinichi de maimuță Vero a fost evaluată prin testul de reducere MTT, așa cum a fost descris anterior, cu ușoare modificări. Celulele au fost însămânțate la o densitate de 1 × 105 celule/ml (100 μl) în plăci de microtitrare cu 96 de puțuri și incubate la 37°C și 5% CO2 într-un mediu umidificat. După 24 h de incubare, probele (100 μl) la diferite concentrații finale au fost adăugate în godeurile care conțineau celule. Doxorubicina a fost utilizată ca referință pozitivă. S-a inclus, de asemenea, un martor alb adecvat cu concentrații echivalente de acetonă, iar plăcile au fost incubate în continuare timp de 48 h într-un incubator cu CO2. Ulterior, mediul din fiecare fântână a fost aspirat din celule, care au fost apoi spălate cu PBS, iar în final s-a adăugat mediu proaspăt (200 μl) în fiecare fântână. Apoi, s-au adăugat 30 μl de MTT (5 mg/ml în PBS) în fiecare gode și plăcile au fost incubate la 37°C timp de 4 h. Mediul a fost aspirat din godeuri și s-a adăugat DMSO pentru a solubiliza cristalele de formazan formate. Absorbția a fost măsurată pe un cititor de microplăci BioTek Synergy la 570 nm. Inhibarea creșterii celulare pentru fiecare extract a fost exprimată în termeni de valori LC50, definite ca fiind concentrația care a cauzat o inhibiție de 50% a viabilității celulare. Valorile indicelui de selectivitate (SI) au fost calculate prin împărțirea valorilor LC50 de citotoxicitate la valorile MIC (SI = LC50/MIC). Testele au fost efectuate în patru exemplare și fiecare experiment a fost repetat de trei ori.

Analiză statistică

Toate experimentele au fost efectuate în trei exemplare, iar valorile au fost exprimate ca medie ± abatere standard. Diferențele dintre valori au fost evaluate pentru semnificație folosind analiza varianței, iar rezultatele au fost comparate folosind cea mai mică diferență semnificativă (LSD) a lui Fisher la un nivel de semnificație de 5%.

.