Interacțiunea razelor X cu electronii dintr-un cristal dă naștere unui model de difracție, care matematic este transformata Fourier a distribuției densității electronice. Cu toate acestea, detectoarele utilizate pentru măsurarea razelor X pot măsura doar amplitudinea razelor X difractate; deplasările de fază, care sunt necesare pentru a utiliza transformata Fourier și a găsi distribuția densității electronice, nu pot fi măsurate direct prin această metodă. Acest lucru este cunoscut în comunitatea de fizicieni sub numele de „problema fazei”. În termeni mai simpli, fazele nu pot fi găsite din amplitudinile măsurate ale razelor X. Trebuie făcute alte extrapolări și trebuie efectuate experimente suplimentare pentru a obține o hartă a densității electronice. De multe ori, datele existente cu privire la proprietățile fizice și chimice ale compusului pot fi de ajutor atunci când există o hartă de densitate slabă. O altă metodă cunoscută sub numele de sinteza Patterson este foarte utilă pentru a afla o estimare inițială a fazelor și este foarte utilă pentru etapele inițiale de determinare a structurii proteinelor atunci când fazele nu sunt cunoscute. Problema poate fi simplificată prin găsirea unui atom, de obicei un metal greu, folosind Patterson Synthesis și apoi folosind poziția acelui atom pentru a estima fazele inițiale și pentru a calcula o hartă inițială a densității electronice care poate ajuta în continuare la modelarea poziției altor atomi și poate îmbunătăți și mai mult estimarea fazelor. O altă metodă se numește înlocuire moleculară; aceasta localizează locația structurii proteice în celulă. În plus față de metoda înlocuirii moleculare, problema fazelor poate fi rezolvată și prin metoda înlocuirii izomorfe, metoda difracției anormale cu lungimi de undă multiple, metoda difracției anormale cu o singură lungime de undă și metode directe.

Înlocuire molecularăEdit

Problema fazelor poate fi rezolvată prin existența unui model atomic care poate calcula fazele. Un model poate fi obținut dacă se cunoaște structura proteică aferentă. Cu toate acestea, pentru a construi acest model atomic, trebuie să se determine orientarea și poziția modelului în noua celulă unitară. Acesta este momentul în care intervine tehnica, înlocuirea moleculară (sau MR).

Înlocuirea moleculară, cunoscută și sub numele de MR, este o metodă de rezolvare a problemelor de fază în cristalografia cu raze X. MR localizează orientarea și poziția unei structuri proteice cu celula sa unitară, a cărei structură proteică este omoloagă cu structura proteică necunoscută care trebuie să fie determinată. Fazele obținute pot ajuta la generarea hărților de densitate electronică și pot ajuta la producerea intensităților calculate ale poziției modelului structurii proteice față de structurile observate din experimentul de cristalografie cu raze X.

Metoda MR este, de asemenea, eficientă pentru rezolvarea structurilor cristaline macromoleculare. Această metodă necesită mai puțin timp și efort pentru determinarea structurală, deoarece nu este necesar să se pregătească derivații atomilor grei și să se colecteze date. Metoda este directă, iar construirea modelului este simplificată, deoarece nu necesită urmărirea lanțului.

Această metodă constă în două etape:

1. o căutare rotațională pentru orientarea modelului omolog în celula unitară sau țintă
2. o țintă translațională în care noul model orientat este poziționat în celula unitară

Editare bazată pe Patterson (înlocuire moleculară)

Hărțile Patterson sunt hărți vectoriale interatomice care conțin vârfuri pentru fiecare atom înrudit din celula unitară. Dacă hărțile Patterson au fost generate pe baza datelor derivate din hărțile de densitate electronică, cele două hărți Patterson ar trebui să fie strâns legate între ele numai dacă modelul este orientat corect și plasat în poziția corectă. Acest lucru ne va permite să deducem informații despre localizarea structurii proteice necunoscute cu celula sa. Cu toate acestea, există o problemă cu înlocuirea moleculară, aceasta are șase dimensiuni, trei parametri pentru a specifica orientarea și poziția. Cu hărțile Patterson, ea poate fi împărțită în subansambluri de parametri pentru a examina fiecare parte în parte.

Funcția de rotațieEdit

Funcția de rotație are vectori intramoleculari care depind doar de orientarea moleculei și nu de poziția ei, deoarece chiar și atunci când molecula este translatată în celula unitară, toți atomii sunt deplasați cu aceeași cantitate, dar vectorii dintre atomi sunt aceiași. Harta Patterson pentru structura necunoscută a proteinei este comparată cu structura omologă cunoscută a proteinei în diferite orientări

Funcția de rotație clasicăEdit

Pentru a găsi orientarea, determinați axa de rotație și unghiul de rotație în jurul acelei axe. Vor fi necesari doi parametri pentru a defini o axă (un vector de la centrul sferei la un punct de pe suprafața sferei). Axa de rotație pornește paralel cu axa z și se rotește în jurul axei y cu unghiul ᶱ, apoi obiectul se rotește în jurul axei z cu unghiul ᶲ, iar în final se rotește în jurul axei de rotație cu unghiul ᵠ. Acestea specifică un punct de pe suprafața unei sfere unitare.

Fast Rotation FunctionEdit

Funcția de rotație poate fi calculată prin compararea a două hărți Patterson sau a vârfurilor din aceste Patterson. Funcția de rotație poate fi calculată mult mai rapid cu ajutorul transformărilor Fourier numai dacă Patterson-urile au fost exprimate în termeni de armonici sferice.

Direct Rotation FunctionEdit

În funcția de rotație directă, structura proteică poate fi plasată în celula unitară a structurii necunoscute și Patterson-ul pentru molecula orientată este comparat cu Patterson-ul întregii structuri necunoscute.

Translation FunctionEdit

După ce se cunoaște orientarea structurii cunoscute, modelul acesteia (harta densității electronice) poate fi orientat pentru a calcula factorii de structură, unde se folosește o funcție de corelație pentru a determina vectorul de translatare a modelului peste cel omolog în cadrul unei unități asimetrice.

Cu modelele corecte de fazare orientate și translatate ale structurii proteice, este suficient de precisă pentru a obține hărțile densității electronice din fazele derivate. Hărțile de densitate a electronilor pot fi folosite pentru a construi și rafina modelul structurii necunoscute.

Difuzie Anomală pe mai multe lungimi de undăEdit

Razele X sunt generate în mașini mari numite sincrotroni. Sincrotrotronii accelerează electronii până aproape de viteza luminii și îi fac să călătorească printr-un poligon-ring metalic mare și gol. La fiecare colț, magneții îndoaie fluxul de electroni, provocând emisia de energie sub formă de radiații electromagnetice. Deoarece electronii se deplasează cu viteza luminii, ei emit raze X de înaltă energie.

Beneficiile utilizării sincrotronilor constă în faptul că cercetătorii nu trebuie să cultive mai multe versiuni ale fiecărei molecule cristalizate, ci doar un singur tip de cristal care conține seleniu. Ei au apoi posibilitatea de a regla lungimea de undă pentru a se potrivi cu proprietățile chimice ale seleniului. Această tehnică este cunoscută sub numele de difracție anormală pe mai multe lungimi de undă. Cristalele sunt apoi bombardate de mai multe ori cu lungimi de undă de diferite lungimi și, în cele din urmă, apare un model de difracție care le permite cercetătorilor să determine locația atomilor de seleniu. Această poziție poate fi folosită ca referință sau marker pentru a determina restul structurii. Beneficiile acestei metode permit cercetătorilor să își colecteze datele mult mai rapid.

Metoda înlocuirii izomorfeEdit

Această metodă compară modelele de difracție a razelor X între cristalul original al proteinei și același tip de cristal cu un adaos de cel puțin un atom cu număr atomic mare. Metoda a fost folosită pentru a determina structura moleculelor mici și, în cele din urmă, pe cea a hemoglobinei de către Max Ferdinand Perutz (1914-2002). Un izomorfism perfect este atunci când cristalul original și derivatul său au exact aceeași conformație a proteinei, poziția și orientarea sau moleculele, precum și parametrii celulei unitare. Singura diferență pe care o au cristalul și derivatul său într-un izomorfism perfect este reprezentată de diferențele de intensitate datorate adăugării de atomi grei pe derivat. Aceste diferențe pot fi identificate manual sau printr-o procedură automată de căutare Patterson, cum ar fi SIR 2002, SHELXD, nB și ACORN, iar aceste informații sunt importante pentru a determina unghiurile de fază ale proteinei. Cu toate acestea, izomorfismul perfect apare cu greu din cauza modificării dimensiunilor celulelor. Pentru proteina cu atom greu, modificarea tolerabilă a dimensiunii celulei este dmin/4, dmin fiind limita de rezoluție. Alți factori, cum ar fi rotația, contribuie, de asemenea, la neizomorfism.

ProceduriEdit

1. Preparați câțiva derivați ai proteinei în structură cristalină. Apoi, măsurați dimensiunea celulei pentru a verifica izomorfismul.
2. Colectați datele de intensitate a razelor X ale proteinei originale și ale derivatei sale.
3. Aplicați funcția Patterson pentru a determina coordonatele atomului greu.
4. Refinați parametrii atomului greu și calculați unghiul de fază al proteinei.
5. Calculați densitatea electronică a proteinei.

Derivatele sunt realizate prin două metode diferite. Metoda preferată constă în îmbibarea cristalului de proteină într-o soluție care este compusă identic cu licoarea mamă, dar cu o ușoară creștere a concentrației de precipitant. O altă metodă este co-cristalizarea, dar nu este folosită în mod obișnuit deoarece cristalul nu crește sau crește în mod neisomorfoid. Procedura de înmuiere depinde de cât de largi sunt porii cristalului. Porii trebuie să fie suficient de largi pentru ca reactivul să se difuzeze în cristal și să ajungă la situsurile reactive de pe suprafața tuturor moleculelor de proteină din cristal.

Metoda difracției anormale cu lungimi de undă multipleEdit

Difuzia anormală cu lungimi de undă multiple (abreviat MAD) este o metodă utilizată în cristalografia cu raze X care ne permite să determinăm structurile macromoleculelor biologice, cum ar fi proteinele și ADN-ul, pentru a rezolva problema de fază. Cerințele pentru structură includ atomi care provoacă o împrăștiere semnificativă a razelor X; în special sulf sau ioni metalici din metaloproteine. Deoarece seleniul poate înlocui sulful natural, acesta este mai frecvent utilizat. Utilizarea acestei tehnici facilitează foarte mult cristalograful de la utilizarea metodei Multiple Isomorphous Replacement (MIR), deoarece prepararea compușilor grei este superfluă.

această metodă este utilizată pentru a rezolva problemele de fază, atunci când nu există date disponibile privind difracția împrăștiată în afară de amplitudini. Mai mult decât atât, este utilizată atunci când un atom de metal greu este deja legat în interiorul proteinei sau când cristalele proteice nu sunt izomorfe, ceea ce nu este potrivit pentru metoda MIR. Metoda a fost utilizată în principal pentru soluții de metale grele, aceste enzime metalice provin în mod normal din seria I de tranziție și din vecinii lor. este important să se dispună de o sursă pentru un câmp magnetic puternic pentru a efectua acest experiment, un mediu precum cel subteran ar trebui luat în considerare. Un accelerator de particule numit sincrotron este, de asemenea, necesar pentru această metodă.

Metoda difracției anormale pe o singură lungime de undăEdit

În comparație cu difracția anormală pe mai multe lungimi de undă (MAD), difracția anormală pe o singură lungime de undă (SAD) utilizează un singur set de date de la o singură lungime de undă. Principala diferență benefică între MAD și SAD este că, în cazul SAD, cristalul petrece mai puțin timp în fasciculul de raze X, ceea ce reduce potențialele daune cauzate de radiații moleculei. De asemenea, deoarece SAD utilizează o singură lungime de undă, este mai eficient din punct de vedere al timpului decât MAD.

Hărțile de densitate electronică derivate din datele de difracție anormală cu o singură lungime de undă trebuie să sufere modificări pentru a rezolva ambiguitățile de fază. O tehnică obișnuită de modificare este aplatizarea cu solvent, iar atunci când SAD este combinat cu aplatizarea cu solvent, hărțile de densitate electronică rezultate sunt de o calitate comparabilă cu cele care sunt derivate din faza MAD completă. Aplatizarea solventului implică ajustarea densității electronice a regiunilor interstițiale dintre moleculele de proteine ocupate de solvent. Se presupune că regiunea solventului este relativ dezordonată și lipsită de caracteristici în comparație cu proteina. Netezirea densității de electroni din regiunile de solvent va spori densitatea de electroni a proteinei la un grad interpretabil. Această metodă se numește ISAS, iterative single-wavelength anomalous scattering.

Metode directeEdit

Metoda directă poate ajuta la recuperarea fazelor folosind datele pe care le obține. Metoda directă estimează fazele inițiale și de expansiune folosind o relație triplă. Relația triplă (trio) este relația dintre intensitatea și faza unei reflexii cu alte două intensități și faze. Atunci când se utilizează această metodă, dimensiunea structurii proteice contează, deoarece distribuția probabilității fazei este invers proporțională cu rădăcina pătrată a numărului de atomi. Metoda directă este cea mai utilă tehnică pentru rezolvarea problemelor de fază.

.