Aminoglycosides: Perspectives on Mechanisms of Action and Resistance and Strategies to Counter Resistance
Baze structurale pentru mecanismul de acțiune
ARNrn-ul 16S din Escherichia coli este bine studiat printre subunitățile de ARNr și, în special, au fost analizate interacțiunile diferitelor antibiotice aminoglicozide cu ARNr 16S și efectele lor asupra procesului de traducere a ARNm în polipeptide (35). Structuri similare de ARNr există și la alte organisme, cum ar fi drojdia și Tetrahymena (33). Tratarea ARNr cu o aminoglicozidă protejează mai multe baze nucleice din ARNr de modificarea chimică, ceea ce implică faptul că aceste molecule posedă afinități ridicate pentru anumite situsuri din ARNr. Acest mod de legare a fost comparat de Noller (35) cu cel al inhibitorilor enzimatici, care se leagă de obicei de situsurile active ale enzimelor și interferează cu activitățile acestora. Diferite clase de antibiotice aminoglicozide se leagă de diferite situsuri de pe ARNr, în funcție de complementaritatea structurală dintre cele două. De exemplu, se crede că neomicina, paromomicina (Fig. 1), gentamicina și kanamicina se leagă de situsul A de pe ARNr 16S în E. coli într-un mod similar și s-a demonstrat că protejează bazele A1408 și G1494 în experimentele de identificare a amprentei chimice (Fig. 2) (33). Patru baze, A1408, A1492, A1493 și G1494, din situsul A al ARNr interacționează cu ARNt, deși cu afinități diferite. Legarea aminoglicozidelor menționate mai sus la situsul A din regiunea de decodare (adică locul de recunoaștere a codonilor și anticodonilor) interferează cu recunoașterea exactă a ARNt cognat de către ARNr în timpul traducerii (35). Se crede că aceste interacțiuni interferează, de asemenea, cu translocarea ARNt de la situsul A la situsul peptidil-ARNt (situsul P).
(A) Vedere stereo a structurii parțiale a ARNr 70S complexat cu trei molecule de ARNt (cod Protein Databank, 486D). Regiunea situsului A de pe ARNr 16S este reprezentată în alb, unde ARNt aminoacil „A” (în galben) este legat în apropierea situsului A al ARNr. Alte două ARNt, peptidil și de ieșire, „P” (în roșu) și, respectiv, „E” (în verde), sunt, de asemenea, reprezentate. Coloana vertebrală a penultimei tulpini a moleculei de ARNr 16S și bucla 900 sunt reprezentate în violet. Locul de legare a paromomicinei la situsul A este indicat prin săgeata albă. (B) Vedere stereo a structurii în soluție a șablonului ARN A-site legat de paromomicină, care corespunde aproximativ regiunii A-site de pe ARNr 16S în alb în panoul A. Suprafața Connolly a ARN-ului A-site este redată în funcție de potențialul electrostatic cu ajutorul programului MOLCAD (Tripos, Inc., St. Louis, Mo.), iar aminoglicozidul este reprezentat în formă de bilă și baston. Potențialul cel mai electronegativ este redat în albastru, iar potențialul cel mai electropozitiv este redat în roșu pe suprafață; toate celelalte culori arată potențialele între albastru și roșu. Săgeata în alb arată curbura generată de A1492, care nu are un partener de împerechere a bazelor. Săgeata în galben arată buzunarul generat de perechea de baze A1408 – A1493 și A1492. Săgeata cu roșu arată localizarea 3-aminei de pe inelul II, locul de acetilare de către AAC(3).
Puglisi și colaboratorii (12-14, 39) au furnizat recent dovezi structurale privind modul de interacțiune al paromomicinei, o aminoglicozidă reprezentativă din clasa neomicinei, cu un șablon de ARN de 27 de nucleotide care a fost proiectat pentru a imita regiunea situsului A al ARNr 16S din E. coli (Fig.3A). Proiectarea șablonului de ARN s-a bazat pe cunoștințele anterioare conform cărora paromomicina interacționează cu perechea de baze C1407 – G1494, A1408, A1493 și U1495 și că aceste baze sunt absolut necesare pentru o legare de mare afinitate (39) (reprezentate în gri în Fig. 3A). Caracteristici structurale suplimentare, cum ar fi buzunarul creat de asimetria din regiunea buclă internă datorită prezenței lui A1492 și perechea de baze C1409 – G1491 în regiunea inferioară a tulpinii, sunt, de asemenea, importante. Aceste caracteristici structurale creează în mod colectiv un buzunar care este optim pentru legarea paromomicinei (a se vedea mai jos).
(A) Modelul șablonului ARN al situsului A utilizat pentru a studia interacțiunile paromomicinei. Caseta reprezintă porțiunea de ARNr care este omologă cu situsul A. (B) Șablonul de ARN aptamer utilizat pentru a studia interacțiunile tobramicinei.
În șablonul de ARN nativ al situsului A, tulpina are interacțiuni de împerechere a bazelor la U1406 – U1495 (necanonice) și C1407 – G1494 (Fig 3A). La legarea paromomicinei, structura distinctă formată de A1408, A1492 și A1493 este stabilizată (Fig. 2B), iar bazele A1408 și A1493 formează o pereche de baze necanonice (12, 39). Nucleotidul A1492, care nu are nicio interacțiune de împerechere a bazelor, creează o încovoiere în structura ARN, iar efectele combinate ale lui A1492 și ale perechii de baze A1408 – A1493 creează o umflătură în situsul A unde se leagă paromomicina și extinde și mai mult unghiul încovoierii (Fig. 2B). Grupurile funcționale de pe paromomicină, cum ar fi grupările hidroxil și amino, participă la interacțiuni specifice cu molecula de ARN (a se vedea mai jos).
Pungărașul creat de A1492 și de perechea de baze A1408 – A1493 este ocupat de inelul II al paromomicinei, iar acest inel se suprapune peste baza G1491 (reprezentată printr-o săgeată galbenă în Fig. 2B) (12). Inelul I al paromomicinei realizează contacte specifice cu perechile de baze conservate „universal” U1406 – U1495 și C1407 – G1494 din ARNr. Este demn de remarcat faptul că inelul I este absolut necesar pentru legarea specifică a antibioticelor aminoglicozide la ARNr. Inelele III și IV ale paromomicinei extind aceste interacțiuni și mai mult în șanțul principal al ARNr. Părțile amino și hidroxil contribuie în principal la interacțiunile nespecifice ale paromomicinei cu ARNr; prin urmare, acestea nu sunt interacțiuni dependente de secvență. Un alt aspect important este faptul că perechea de baze C1409 – G1491 asigură sediul pentru legarea aminoglicozidului în buzunar, iar o pereche de baze nepotrivită în această poziție duce la pierderea legăturii (12). În general, aminoglicozidele care au caracteristici structurale comune cu paromomicina se leagă de ARNr în mod similar (13). Cu toate acestea, se pare că diferite antibiotice aminoglicozide se leagă la același situs de legare în mai multe conformații (28). În esență, conformația aminoglicozidului care se leagă de ARN trebuie să satisfacă constrângerile electronice și sterice ale situsului de legare. Într-un alt studiu privind complexul de gentamicină Cla și șablonul ARN al situsului A, inelele I și II ale gentamicinei Cla (care sunt similare cu cele ale paromomicinei) au prezentat interacțiuni de legare similare cu cele din complexul de paromomicină și șablonul ARN al situsului A (57). Cu toate acestea, inelul III din gentamicina Cla interacționează cu perechile de baze U1406 – U1495 și G1405 – C1496 din regiunea tulpinii superioare (Fig. 3A). Pornind de la aceste observații, Puglisi și colaboratorii (57) au propus că toate aminoglicozidele care țintesc situsul A al ARNr 16S se leagă într-un mod comun, similar cu inelele I și II din paromomicină și gentamicină.
Deși structura generală a ARNr este conservată între toate speciile în sens evolutiv, există diferențe care fac ca legarea aminoglicozidelor să fie mai specifică – cu o afinitate de cel puțin 10 ori mai mare – la ARNr al procariotelor decât la cel al eucariotelor (19, 35, 38). Aceasta nu este o diferență mare în ceea ce privește afinitatea de legare și poate explica în parte efectele toxice ale acestor antibiotice în sistemele mamiferelor. ARNr eucariot conține o guanină în locul lui A1408, rezultând o pereche de baze G1408 – A1493. În plus, perechea de baze corespunzătoare de la C1409 – G1491 nu există la eucariote. Aceste diferențe au ca rezultat colectiv afinități mai scăzute ale aminoglicozidelor pentru ARNr eucariot (12, 19, 35, 38). După ce am subliniat aceste diferențe, legarea aminoglicozidelor la situsul A al ARNr la procariote modifică conformația situsului A și afectează interacțiunile specifice ale ARNm și ARNt la acest situs, ceea ce duce la interacțiuni incorecte codon-anticodon. Până în prezent, există puține informații structurale cu privire la specificul acestor interacțiuni la nivel ribozomal (a se vedea mai jos), dar consecința clară și finală este întreruperea procesului de traducere.
Un alt studiu structural a fost efectuat asupra legării tobramicinei (Fig.1) de un aptamer de ARN (23). Aptamerul de ARN care a fost utilizat în acest studiu a fost un ARN cu buclă stem de 26 de nucleotide (Fig. 3B). În acest aptamer de ARN există patru perechi de nepotriviri, U7 – G20, G8 – U19, G9 – A18 și U11 – U16, care fac parte din bucla în formă de ac de păr cu fermoar. Tobramicina se leagă în această canelură parțial încapsulată de suprafața canelurii profunde și de baza de guanină a reziduului G15 (Fig. 4). În acest complex, inelul I al tobramicinei este așezat pe fundul șanțului profund. Una dintre grupările amino de pe inelul II al tobramicinei interacționează cu coloana vertebrală de fosfat din șanțul profund, iar cealaltă grupare amino este expusă la solvent. Inelul III este poziționat în centrul șanțului adânc, cu grupările hidroxilice îndreptate spre fundul șanțului. S-a sugerat că conformația aptamerului ARN descris mai sus este similară cu cea a buclelor de tip ac de păr din ARNt și ARNr (23).
Vedere stereo a complexului de tobramicină legată de aptamerul de ARN. Suprafața Connolly verde reprezintă o porțiune a situsului de legare a aminoglicozidelor.
Structura cu raze X cu rezoluție de 7,5Å a complexului funcțional al ARNr 70S dinT. thermophilus care conține ARNt și ARNm este utilă pentru a pune în perspectivă discuția de mai sus (5). Pornind de la această structură, ne-am putea imagina cât de bine s-ar potrivi studiile model cu șabloane de ARN mai mici, cum ar fi aptamerul tobramicină-ARN și ARN-site A cu paromomicină (a se vedea mai sus), în structura completă a ARNr. Situl A din subunitatea de ARNr 16S a ARNr 70S se observă în apropierea interfeței dintre ARNt și subunitatea de ARNr 50S, în apropierea perechii codon-anticodon (Fig. 2A). În urma comparării structurii în soluție a șablonului ARN al situsului A cu situsul A din structura cu raze X a ARNr 70S, structura cu raze X a părut a fi strâns legată de șablonul ARN legat de paromomicină, dar nu și de structura în soluție nativă a șablonului ARN al situsului A (5). Acest lucru este intrigant și sugerează că, probabil, în forma funcțională, umflătura sau curbura din apropierea bazelor A1492 și A1493 există întotdeauna în ARNr 70S. Dacă acest lucru ar fi adevărat, înseamnă că buzunarul de legare pentru paromomicină există deja atunci când ARNr 70S devine funcțional; prin urmare, acesta este predispus la inhibarea de către paromomicină. Acest lucru contrazice afirmația conform căreia legarea paromomicinei crește unghiul de încovoiere la locul de legare. Dovezile în sprijinul acestei idei provin dintr-un studiu recent care a sugerat că afinitățile diferitelor aminoglicozide pentru șablonul ARN al situsului A sunt diferite, iar capacitatea acestor antibiotice de a inhiba sinteza proteinelor in vitro variază, de asemenea, (15). Gentamicina și alte câteva antibiotice înrudite interacționează cu ARN-ul A-site cu constante de disociere (Kd) în intervalul micromolar, dar au inhibat un proces de traducere in vitro, cu concentrații inhibitoare de 50% în intervalul nanomolar (15). Această ultimă constatare a fost dedusă ca rezultat al legării aminoglicozidelor la ARNr intact din regiunea de decodare (situsul A), iar diferența de legare la ARNr intact față de cea la ARN șablon situsul A se poate datora diferențelor de conformație a acestor două ARN-uri, așa cum s-a discutat mai sus.
Situsul A realizează contacte slabe cu ARNm și ARNt, ceea ce implică faptul că această regiune joacă un rol în recunoașterea ARNt adecvat prin intermediul unor modificări subtile ale energiei libere (5). Legarea aminoglicozidului în apropierea acestui situs poate afecta procesul delicat al interacțiunilor dintre codon și anticodon. S-a propus, de asemenea, că prezența unei aminoglicozide stabilizează complexul de ARNm și ARNt la nivelul situsului A, care, la rândul său, afectează procesul de traducere (5). Este dificil de presupus toate efectele aminoglicozidelor asupra structurii ARNr, iar studiile structurale ulterioare cu aminoglicozidele legate de complexe, cum ar fi ARNr 70S, vor fi utile în elucidarea și înțelegerea modificărilor subtile care conduc la acțiunile antibiotice ale aminoglicozidelor.
O serie de investigații au folosit sonde sintetice pentru a înțelege interacțiunile dintre șabloanele ARN și aminoglicozide. S-a sugerat că aminoglicozidele se leagă la mai mult de un situs țintă în ribozom (6, 30). Recent, mai multe antibiotice aminoglicozidice, cum ar fi neomicina B, tobramicina și kanamicina A, au fost dimerizate fie simetric, fie asimetric, prin utilizarea unei „legături”, iar afinitățile lor de legare au fost comparate cu cele ale aminoglicozidelor părintești monomerice (30). S-a sugerat că, în cazul în care există mai multe situsuri de legare pe ARN, aminoglicozidele dimerizate ar trebui să se lege cu o afinitate mai mare decât antibioticul părinte, cu condiția ca mai multe situsuri de legare să fie accesibile. Într-adevăr, s-a observat că aminoglicozidele dimerizate se leagă de ribozima Tetrahymena de 20 până la 1 200 de ori mai bine decât aminoglicozidele parentale. O explicație pentru afinitatea de legare mai mare ar putea fi numărul crescut de grupe amino încărcate pozitiv pe aminoglicozidele dimerizate, dar acest efect pare să fie sinergic cu avantajul entropic obținut prin dimerizare (30). Aceasta a indicat, de asemenea, prezența mai multor situsuri de legare de mare afinitate pentru antibioticele aminoglicozide într-o moleculă de ARN. Un alt studiu a încercat să exploateze proprietățile de legare la ARN ale paromomicinei și comportamentele de intercalare ale anumitor compuși, cum ar fi pirenul și portocala tiazolică (48). Această strategie a avut în vedere aminoglicozidele ca mijloc de livrare a agenților intercalanți la ARN. Conjugatul paromomicinei cu portocaliu de tiazol sau cu piren a prezentat proprietăți de legare mai bune la șablonul ARN de 27 de nucleotide A-site. De fapt, constanta de disociere pentru conjugatul paromomicină-portocaliu de tiazol a fost măsurată la 46 nM, care a fost raportată ca fiind cea mai mare afinitate pe care situsul A al ARNr a arătat-o pentru orice ligand.
Cerințele structurale pentru legarea ARN-ului de către aminoglicozide au indicat faptul că o umflătură în secvența de ARN este necesară pentru a permite legarea aminoglicozidelor (7). Prin utilizarea unui derivat cu buclă de tulpină specifică a aptamerului ARN, s-a efectuat o serie de studii de interferență chimică, de modificare chimică și de mutație pentru a înțelege cerințele structurale pentru legarea tobramicinei la aptamerul ARN. Se pare că această aminoglicozidă interacționează în principal cu bazele nucleice din aptamerul ARN, dar nu și cu coloana vertebrală fosfatică. Cu toate acestea, s-a propus ca prezența unei protuberanțe să fie importantă pentru legarea cu mare afinitate a tobramicinei într-un raport stoichiometric și s-a concluzionat că o protuberanță creează o cavitate pentru interacțiunile dintre aminoglicozidă și baza nucleică (7). Această analogie poate fi aplicată la alte situsuri ARN, cum ar fi regiunea Hammerhead și situsul A, unde este prezentă o cavitate din cauza împerecherii necanonice a bazelor sau a buclelor sau umflăturilor care creează un situs adecvat pentru ca aminoglicozidele să interacționeze cu grupările fosfat anionice și bazele nucleice. În acest sens, Westhoff și colegii săi (49) au avansat o propunere conform căreia interacțiunea aminoglicozidelor cu ARN este probabil să fie mai degrabă specifică formei decât secvenței.
În concordanță cu acest concept, câmpurile electrostatice din pliurile ARN au fost considerate ca fiind forța de ghidare pentru legare (a se vedea mai jos). Hermann și Westhoff (20) au reușit să identifice confirmările de andocare a mai multor antibiotice aminoglicozidice în diverse șabloane de ARN, cum ar fi aptamerii tobramicină-ARN și regiunea A-site din ARN 16S, pentru care erau disponibile informații structurale. Pe baza acestor observații, a fost prezis modul de legare a aminoglicozidelor la regiunea elementului de răspuns trans-activator din HIV (20). Într-un alt studiu privind RRE din HIV, regiunea de legare a proteinei Rev, Cho și Rando (8) au investigat rolul unei umflături cu o singură bază și al unei cavități pentru legarea aminoglicozidelor. În concordanță cu ipotezele anterioare, s-a dedus că șanțurile din regiunile nonduplex ale ARN sunt importante pentru legarea cu mare afinitate a aminoglicozidelor la ARN. În acest caz, umflătura unei singure baze nu a afectat legarea, dar cavitatea, o regiune bogată în G formată din două perechi de baze necanonice și un singur U umflat, are o afinitate ridicată pentru aminoglicozide. Modificarea cavității a scăzut afinitatea ARN-ului RRE pentru aminoglicozide, indicând astfel că perechile de baze necanonice care conțin umflături sunt locurile principale de legare a aminoglicozidelor în acest șablon de ARN (8).
.