Generarea de șoareci knockout

Tehnologiile utilizate pentru a genera șoareci knockout includ recombinarea omoloagă (sau direcționarea genelor) și captarea genelor. Ambele abordări implică utilizarea de celule stem embrionare de șoarece (ES) care sunt izolate din embrioni de șoarece la aproximativ patru zile de la fertilizare. În prima abordare, cea a recombinării omoloage, în nucleul unei celule ES de șoarece se introduce ADN artificial cu secvențe flancate care sunt omoloage (identice) cu cele care apar în amonte și în aval de secvența ADN a genei țintă. Celula ES recunoaște secvențele de flancare omoloage și schimbă ADN-ul existent al genei țintă cu segmente de ADN străin. Cu toate acestea, ADN-ul străin este inactiv. Astfel, încorporarea sa în genomul celulei ES inactivează, sau elimină, gena țintă. ADN-ul străin este de obicei modificat pentru a purta o genă reporter, care marchează sau marchează locația genei existente, permițând cercetătorilor să urmărească prezența acesteia în genomul celulelor de șoarece pe măsură ce celulele se replică. Recombinarea omoloagă este metoda aleasă atunci când este necesar ca o anumită alelă (genă) să fie înlocuită cu o secvență de ADN modificată fără a afecta alte gene din genom.

Capturarea genelor utilizează, de asemenea, ADN artificial care poartă o genă reporter. Cu toate acestea, mai degrabă decât să țintească o genă specifică, ADN-ul străin este încorporat aleatoriu în orice genă din genomul celulelor ES de șoarece. Secvența străină împiedică gena perturbată să codifice produsele sale proteice, făcând astfel gena inactivă. Activarea genei reporter la încorporarea în genomul celulelor ES permite cercetătorilor să urmărească activitatea genei și să deducă funcția genei perturbate.

Secvențele de ADN artificial sunt de obicei introduse în celulele ES de șoarece folosind un retrovirus sau un alt vector viral, iar celulele ES modificate sunt apoi crescute în culturi celulare. După câteva zile, celulele sunt injectate în embrioni timpurii de șoarece, care ulterior sunt implantați în uterul unei femele surogat, unde în cele din urmă se dezvoltă și sunt duși la termen. Puii de șoarece născuți în acest mod conțin atât țesut modificat, cât și nemodificat și, prin urmare, nu sunt șoareci knockout complet. Pentru a genera o pereche de șoareci cu adevărat knockout (knockout omologi), șoarecii trebuie să fie înmulțiți pe parcursul mai multor generații. Inițial, animalele sunt încrucișate cu alți șoareci pentru a produce indivizi heterozigoți (șoareci cu o copie a genei țintă); animalele heterozigote sunt apoi încrucișate între ele pentru a produce homozigoți.