Abstract

Hiperviscozitatea spermei afectează motilitatea spermatozoizilor și poate duce la infertilitate masculină. Acest studiu prospectiv a avut ca scop evaluarea capacității DNazei exogene în îmbunătățirea calității spermei, luând în considerare faptul că DNaza a fost găsită în plasma seminală a mai multor specii și că neutrofilele eliberează cromatină pentru a capta bacteriile. În total, în această analiză au fost comparate șaptezeci și șapte de eșantioane de material seminal cu vâscozitate seminal ridicată (HSV) ca grup de studiu și șaizeci și două de eșantioane de material seminal cu vâscozitate seminal normală (NSV) ca grup de control. Aceste probe de material seminal au fost împărțite în trei grupuri care au primit tratament (a) cu DNază I la 37°C timp de 15 minute, (b) prin centrifugare în gradient de densitate și (c) cu o combinație a celor două metode de mai sus. În urma unui tratament de cincisprezece minute al spermei hipervizuale, motilitatea spermatozoizilor din 83% din probele de spermă a crescut într-un grad semnificativ din punct de vedere statistic. Dimpotrivă, tratamentul cu DNază al materialului seminal cu vâscozitate normală nu a avut astfel de efecte. Tratamentul de mai sus a fost însoțit, de asemenea, de o creștere semnificativă a procentului de spermatozoizi normali, ceea ce a dus la o scădere majoră a indicelui de teratozoospermie. Comparația între probele de material seminal care au fost supuse centrifugării în gradient de densitate după tratamentul cu DNază I, cu cele recoltate doar după tratamentul în gradient de densitate, a arătat că în primul caz rezultatele au fost mai spectaculoase. Evaluarea fiecărui preparat din punct de vedere al randamentului (% din numărul total de spermatozoizi progresiv mobili după tratament în raport cu numărul total inițial de spermatozoizi) a arătat că abordarea combinată a avut ca rezultat un procent de 29,8% față de 18,5% doar cu tratamentul cu densitate (p=0,0121). Tratamentul cu DNază I are ca rezultat o îmbunătățire a motilității și morfologiei spermatozoizilor și ar putea fi benefic pentru bărbații cu spermă hipervezică în cadrul protocoalelor de reproducere asistată.

1. Introducere

Studiile au documentat faptul că hiperviscozitatea spermei (SHV) apare în 12-29% din ejaculate . SHV este o afecțiune care poate duce la infertilitate masculină , deoarece poate afecta grav caracteristicile fizice și chimice ale lichidului seminal . Aceasta a fost asociată cu o motilitate redusă a spermatozoizilor, precum și cu un rezultat slab al fertilizării in vitro și cu o producție crescută de specii reactive de oxigen (ROS). Mai mult, nivelurile de produse de deteriorare oxidativă seminale au fost corelate în mod semnificativ cu vâscozitatea lichidului seminal la bărbații infertili .

Există indicii puternice ale existenței unor căi inhibitorii care afectează calitatea spermatozoizilor prin producerea de ROS în timpul transportului spermatozoizilor prin tractul genital masculin , indicii de deteriorare a spermatozoizilor în timpul manipulării și depozitării în laborator , dar și indicii de producere suplimentară de ROS „automat” după ejaculare, cel puțin în unele cazuri de hiperviscozitate seminală . Această afecțiune este asociată în principal cu infecția glandei sexuale accesorii masculine și cu varicocelul , chiar dacă fiziopatologia nu este încă complet înțeleasă. Mai mult, capacitatea antioxidantă afectată a lichidului seminal a fost detectată în probele oligoastenozoospermice în cazurile de hiperviscozitate seminală . Mai mult, nivelurile excesiv generate de ROS generează peroxidarea lipidică perturbând morfologia membranară . Prezența unor niveluri crescute de leucocite în materialul seminal este asociată cu SHV . În plus, leucocitele sunt o sursă majoră de ERO și de vectori de retrovirusuri în materialul seminal, în timp ce prezența lor a fost asociată cu o scădere a probabilității de concepție, precum și cu o rată de succes mai mică a inseminării intrauterine (IUI) și a FIV convenționale . Mai mult decât atât, SHV este corelată cu compoziția microbiotei seminale și cu prevalența mai mare a bacteriilor patogene .

Au fost propuse mai multe abordări terapeutice în contexte de reducere a vâscozității materialului seminal SHV. Suprahidratarea și masajul prostatic nu au fost eficiente . Aspirarea și expulzarea blândă a materialului seminal, printr-o seringă de 5 ml, sunt aproape ineficiente, deoarece SHV nu este un fenomen mecanic . Proteoliza prin utilizarea chimotripsinei îmbunătățește manipularea materialului seminal hipervisceros, deși apar unele modificări ale proteinelor spermatozoizilor . Luând în considerare faptul că o astfel de procedură poate deteriora structura spermatozoizilor și că în majoritatea cazurilor SHV este corelată cu leucocitospermia , am emis ipoteza că SHV este cauzată de capcanele extracelulare ale neutrofilelor (NETs) și că acestea sunt sensibile la degradarea ADN-ului prin intermediul DNazei I. După cunoștințele noastre, aceasta este prima raportare a utilizării DNazei I, pentru a aborda SHV.

2. Materiale și metode

2.1. Participanți

Un studiu prospectiv a fost efectuat pe parcursul a 3 ani la pacienții cu antecedente de infertilitate la Clinica Medicală din Atena, Locus Medicus, cu următoarele criterii de excludere: varicocel hipogonadism, criptorhidism și obstrucție congenitală a canalelor seminale. Șaptezeci și șapte de probe de material seminal cu VSH au fost obținute ca grup de studiu și șaizeci și două de probe de material seminal normal cu VSN au fost obținute ca grup de control, stratificate după cum urmează. Inițial, un set de treizeci și două de probe de material seminal cu HSV și zece probe de material seminal cu NSV au fost tratate cu DNază I. În plus, un alt set de douăzeci și șase de probe de material seminal cu HSV și cincizeci și două de NSV au fost prelucrate prin metoda de centrifugare în gradient de densitate (DGC). În cele din urmă, nouăsprezece eșantioane de HSV au fost prelucrate printr-o combinație a metodelor, și anume, tratamentul inițial cu DNază I, urmat de DGC. Toți participanții au semnat un formular de consimțământ în cunoștință de cauză înainte de orice implicare.

2.2. Analiza materialului seminal

Eșantioanele de material seminal, obținute prin masturbare după o abstinență sexuală de 3-5 zile, au fost plasate în recipiente sterile. După recoltare, probele de material seminal au fost lăsate să se lichefieze la 37°C și apoi au fost supuse analizei convenționale limite de referință pentru analiza materialului seminal, înainte și după procesul combinat descris mai sus]. Motilitatea a fost evaluată de același biolog cu pregătire oficială (ESHRE), care nu este implicat în studiu. Prezența celulelor albe din sânge (WBC) a fost evaluată prin testul de peroxidază (Leukoscreen FertiPro; Belgia), în conformitate cu orientările OMS 2010 . Deși vâscozitatea a putut fi evaluată prin vâscozimetru cantitativ , viscoelasticitatea materialului seminal a fost estimată prin utilizarea unor pipete de unică folosință din plastic care au permis ca materialul seminal să cadă prin gravitație și observarea lungimii oricărui fir . Bărbații al căror material seminal are o lungime a firului între 2 cm și 4 cm sunt clasificați cu SHV ușoară (53,12%); o lungime a firului între 4 cm și 6 cm (40,62%) este etichetată ca SHV moderată; iar o lungime a firului mai mare de 6 cm este diagnosticată ca SHV severă (6,25%) au fost incluși în grupul de vâscozitate ridicată (HV), în timp ce viscoelasticitatea a fost considerată normală atunci când lungimea firului a fost de 2 cm sau mai mică .

2.3. Tratamentul cu enzime

Efectul DNazei I a fost evaluat în probele de material seminal normal și de vâscozitate ridicată. După lichefiere, DNază I a fost trasă ușor în recipientul steril cu proba de material seminal până la o concentrație finală de 20 U/ml și amestecată în mod constant, urmată de o incubare la 37°C între 15 și 60 de minute. Motilitatea și morfologia probelor de material seminal de mai sus au fost analizate înainte și după digestia enzimatică și s-a evaluat % de PR (motilitate a (a+b) % din numărul total de spermatozoizi) spermatozoizilor înainte de orice tratament (adică % PR inițial).

2.4. Pregătirea materialului seminal

Metoda de centrifugare în gradient de densitate (DGC) a fost efectuată în conformitate cu recomandările producătorului. Gradientul de densitate se prepară prin stratificarea a 1 ml de mediu 40% peste mediul 80% PureSperm® (Nidacon International, Gothenburg, Suedia) într-un tub de centrifugare conic de 15 ml. Materialul seminal a fost așezat pe partea superioară a gradientului și centrifugat la 300 g timp de 20 de minute. Amploarea și forța centrifugării pot fi variate în funcție de calitatea probei: de exemplu, timpul de centrifugare poate fi mărit pentru probele cu vâscozitate ridicată. După centrifugare, cea mai mare parte a supernatantului trebuie îndepărtată cu grijă, iar peletul trebuie plasat într-un tub nou, curat și resuspendat bine în 5 ml de mediu pentru a elimina mediul de gradient de densitate. Apoi se centrifughează la 200 g timp de 10 minute, se îndepărtează supernatantul și se resuspendă peletul final în mediul steril pentru tehnologiile de reproducere asistată (ART). În cele din urmă, în tratamentul combinatoriu, probele cu vâscozitate ridicată au fost tratate inițial cu DNază I și apoi pregătite cu metoda DGC descrisă mai sus. S-au determinat concentrația, motilitatea și morfologia înainte și după preparare.

Potrivit faptului că numărul total de spermatozoizi progresiv mobili (TPMSC) după spălare ar putea fi util pentru a prezice eficacitatea inseminării intrauterine, randamentul fiecărei metode a fost, de asemenea, evaluat după cum urmează: procentul de TPMSC după tratamentul fie cu preparatul DGC, fie cu DNază I sau cu tratamentul combinat cu DNază I urmat de prepararea DGC a fost împărțit la numărul total de spermatozoizi înainte de tratament. Mai mult, rezultatul randamentului (și anume, % PR final/total spermatozoizi înainte) a fost comparat cu % PR inițial/total spermatozoizi înainte de orice tratament. Randamentul a fost evaluat în probele de spermă cu vâscozitate ridicată sau normală. Deși, nu există un consens cu privire la numărul de spermatozoizi mobili administrați în ART , este în general acceptat faptul că recuperarea numărului maxim de spermatozoizi mobili din fiecare probă de spermă după orice tratament este de o importanță majoră.

2.5. Analiza statistică

Datele au fost analizate prin ANOVA cu o singură cale urmată de testul Kruskal-Wallis de comparație multiplă folosind GraphPad Prism 6.0. O valoare p mai mică de 0,05 a fost considerată semnificativă din punct de vedere statistic.

3. Rezultate

Concentrația de celule albe din sânge (WBC) este prezentată în figura 1. Există o diferență semnificativă din punct de vedere statistic între toate grupurile (p=0,0238 one-way ANOVA). Mai mult, diferența statistică în cadrul grupului HV este de 0,0018.

Continuarea incubării timp de încă cincisprezece minute (la 21 de subiecți din 32) (pentru un timp total de treizeci de minute, t=30) a mărit motilitatea unei fracțiuni de spermatozoizi la 9,524% (t=30) de la 1,761% (t=0) (p=0,046, test de comparație multiplă), așa cum se demonstrează în figura 3. În mod interesant, mișcarea PR s-a îmbunătățit dramatic de la 24% (t=0) la 45,047% (t=30) (p<0,0001, test de comparație multiplă) de spermatozoizi. Motilitatea fracțiunilor (c) și (d) de spermatozoizi a scăzut într-un mod semnificativ din punct de vedere statistic de la 35,714% la 22,08% (p=0,001, test de comparație multiplă) și, respectiv, de la 40,238% la 32,238% (p=0,039, test de comparație multiplă). Reevaluarea vâscozității spermatozoizilor după tratamentul cu DNază I a arătat că în majoritatea cazurilor vâscozitatea a fost normalizată sau cel puțin îmbunătățită.

Apoi am comparat rezultatele spermatozoizilor care au fost supuși centrifugării în gradient de densitate după tratamentul cu DNază I, cu cele constatate după tratamentul în gradient de densitate singur. Din cauza limitelor eșantioanelor, cele două proceduri nu au fost utilizate pe eșantioane acumulate de la aceiași subiecți, ci pe eșantioane de la subiecți diferiți a căror vâscozitate a spermei era ridicată. Tratamentul prin centrifugare în gradient de densitate a fost utilizat și pentru inseminarea intrauterină (IUI). După cum este ilustrat în figura 4, procentul de mișcare (a) după centrifugarea în gradient de densitate în urma tratamentului cu DNază I a crescut de la 3,416 % la 35,083 % din spermatozoizi (o îmbunătățire de 10,27 ori), comparativ cu 6,333 % la 26,866 % din spermatozoizi (o îmbunătățire de 4,242 ori) în cazul tratamentului cu gradient de densitate singur (p<0,0001, testul Kruskal-Wallis cu comparații multiple). În ceea ce privește mișcarea (b), după centrifugarea în gradient de densitate în urma tratamentului cu DNază I, îmbunătățirea a fost, de asemenea, semnificativă din punct de vedere statistic (de la 28,583 % la 40,916 % de spermatozoizi (o creștere de 1,43 ori), p=0,0112). În grupul de tratament prin centrifugare în gradient de densitate, îmbunătățirea respectivă a crescut de la 34,533 % la 46,466 % de spermatozoizi (o îmbunătățire de 1,34 ori), deși diferența dintre grupuri nu a fost semnificativă din punct de vedere statistic (ns, testul Kruskal-Wallis de comparație multiplă). Mai mult, mișcarea PR în primul grup a crescut de la 32% la 76% din spermatozoizi (de 2,375 de ori) în comparație cu o îmbunătățire de 1,776 de ori în cel de-al doilea grup (de la 40,866% la 72,666% din spermatozoizi) (nesemnificativ din punct de vedere statistic între grupuri, testul Kruskal-Wallis de comparație multiplă). Motilitatea fracțiunilor (c) și (d) de spermatozoizi a scăzut de la 36,083% la 10,583% și, respectiv, de la 31,916% la 13,583%. Scăderea respectivă în grupul de tratament prin centrifugare în gradient de densitate singur a fost de la 29,40% la 14,80% (nesemnificativ din punct de vedere statistic între grupuri, test Kruskal-Wallis de comparație multiplă).

Au fost evaluate TPMSC post-spălate în raport cu numărul inițial (randament) al fiecărui preparat (M&M). Randamentul tratamentului cu gradient de densitate în cazul unui individ fără vâscozitate a materialului seminal a fost de 27,096% (figura 5, w/o V-d). Randamentul aceluiași preparat în cazul indivizilor cu vâscozitate ridicată (Figura 5, HV-d) a fost de 18,519%. Schimbarea în ambele cazuri în ceea ce privește controlul lor respectiv (adică Figura 5, w/o V, HV) a fost semnificativă din punct de vedere statistic (p<0,0001 și, respectiv, p=0,0377, testul Kruskal-Wallis de comparație multiplă), ceea ce denotă faptul că o mulțime de spermatozoizi PR au fost pierduți după tratamentul cu DGC. Atunci când spermatozoizii de la indivizii cu vâscozitate ridicată au fost supuși unui tratament cu DNază (Figura 5, HV-DNază), randamentul corespunzător a fost de 42,47%, în timp ce comparația dintre tratamentul cu gradient de densitate (HV-d) și tratamentul cu DNază (HV-DNază) a avut ca rezultat un p<0,0001 în ceea ce privește grupul HV, testul Kruskal-Wallis de comparație multiplă. În ciuda magnitudinii realizărilor de mai sus, combinația de tratament cu DNază care este urmată de tratamentul cu gradient de densitate (Figura 5, HV-DNază-d) are ca rezultat un randament de 29,782% (p=0,0121 în raport cu grupul HV, testul Kruskal-Wallis de comparație multiplă). Mai mult, preparatul combinat (HV-DNase-d) a fost comparat cu procentul de spermatozoizi PR din sperma cu vâscozitate ridicată înainte de orice tratament (Figura 5, HV) și a avut ca rezultat p=0,448, ceea ce înseamnă că majoritatea spermatozoizilor PR au fost recuperați. Mai mult, în comparație cu grupul w/oV-d, nu există nicio diferență semnificativă din punct de vedere statistic, deoarece p=0,619 testul Kruskal-Wallis de comparație multiplă.

În continuare, aprecierea morfologiei spermatozoizilor după o incubare de cincisprezece minute cu DNază I are ca rezultat o creștere semnificativă din punct de vedere statistic a procentului de spermatozoizi normali de la 5,468 % la 7,25 %, p=0,0197, așa cum este ilustrat în figura 6. În același timp, anomaliile la nivelul capului au scăzut de la 81,75 % la 74,937 % (p = 0,0004), în timp ce anomaliile la nivelul gâtului au scăzut de la 22,062 % la 19,343 % (p = 0,0197). Anomaliile cozii și picătura citoplasmatică urmează același tipar. Ca urmare a acestor modificări ale morfologiei, este rezonabil să se observe un impact major asupra indicelui de teratozoospermie (TZI). Așa cum este ilustrat în figura 6, acesta a scăzut de la 1,205 la 1,084 (p<0,0001).

4. Discuție

În acest studiu, am emis ipoteza că hiperviscozitatea materialului seminal își are originea în NET-uri. Datele prezentate arată că digestia ADN-ului extrudat al NET-urilor este fezabilă, ceea ce duce la îmbunătățirea motilității spermatozoizilor. Digestia enzimatică a ADN-ului din plasma seminală a fost examinată în vederea creșterii motilității spermatozoizilor, făcându-i astfel potriviți pentru utilizarea în ART. Utilizarea DNazei I după lichefierea spermatozoizilor a dus la îmbunătățirea atât a motilității, cât și a morfologiei spermatozoizilor. Au fost utilizate mai multe momente de incubare pentru a obține cele mai bune rezultate, care au fost obținute după 15 minute de incubare. Scopul studiului a fost îmbunătățirea randamentului inseminării intrauterine, în cohorta de bărbați cu subfertilitate, ale căror spermatozoizi se caracterizează printr-o vâscozitate ridicată, cel mai probabil din cauza obstacolelor cauzate de ADN-ul extrudat. În plus, utilizarea de DNază I a îmbunătățit morfologia anormală care coexistă de obicei cu vâscozitatea ridicată. Îmbogățirea spermatozoizilor a fost, de asemenea, evaluată în funcție de numărul final de spermatozoizi izolați, atât cei cu progresie rapidă, cât și cei cu progresie lentă.

Îmbunătățirea semnificativă din punct de vedere statistic a morfologiei spermatozoizilor în urma tratamentului cu DNază I poate sugera că aceste anomalii se materializează după ejaculare și se mențin din cauza vâscozității ridicate. Având în vedere că sperma hipervâscoasă are o capacitate antioxidantă totală redusă , prezența spermatozoizilor în acest mediu poate induce peroxidarea lipidică și deteriorarea ADN-ului și, în cele din urmă, afectarea morfologiei . Cel puțin unele dintre aceste anomalii morfologice s-au dovedit a fi reversibile prin tratamentul cu DNază I. Această ameliorare sugerează aplicarea optimă a tratamentului de mai sus în cazurile în care nu există o cerere atât de mare pentru un număr mare de spermatozoizi direct mobili, ca în cazul inseminării intrauterine, dar în care există o cerere pentru cea mai bună morfologie posibilă, cum este cazul fie al FIV, fie al procedurii ICSI pentru fertilizare .

Rezultatele noastre arată că aplicarea DNazei I este eficientă numai în prezența hiperviscozității. După cum arată figura 2(b), în absența hiperviscozității, utilizarea DNazei I nu are efect. Mai exact, în condiții de vâscozitate normală și indiferent de motilitatea spermatozoizilor, digestia enzimatică nu a dus la nicio diferență semnificativă din punct de vedere statistic în niciunul dintre parametrii examinați. Dimpotrivă, în cohorta de spermă hipervâscoasă, utilizarea enzimei a dus la îmbunătățirea motilității PR într-o manieră semnificativă din punct de vedere statistic, după cum se arată în figura 2(a). În plus, nu au existat diferențe în ceea ce privește motilitatea și recuperarea morfologică a spermatozoizilor în grupul HV în funcție de vâscozitatea severă sau moderată, deși numărul de probe de material seminal cu vâscozitate severă a fost scăzut. În plus, după cum se arată în figura 5, diferența semnificativă din punct de vedere statistic în urma preparării DGC între grupul de vâscozitate ridicată (HV-d) și grupul de vâscozitate normală (w/oV-d) este de 0,0179, ceea ce sugerează că se poate obține o îmbunătățire. În plus, în aceeași figură, randamentul tratamentului combinat (HV-DNase-d) a dus la recuperarea unui procent de spermatozoizi PR, care a atins nivelul spermatozoizilor corespunzători la bărbații cu vâscozitate ridicată (HV) înainte de tratament, deoarece procentul final de PR (29,782%, HV-DNase-d) în primul caz nu are nicio diferență statistică față de PR inițial (26,478%, HV înainte de tratament), p=0,4480. Semnificația acestei abordări combinate, deși scade randamentul în comparație cu tratamentul cu DNază singur (p<0001 între HV-d și HV-DNază), a fost susținută de faptul că tratamentul cu gradient de densitate a sustras din omologii spermatozoizilor recuperați, (c) și (d) clasa (c) și (d), purificându-i astfel. În schimb, diferența statistică corespunzătoare dintre randamentul preparatului DGC (HV-d, 18,519%) și „HV înainte de tratament” (26,478%) a fost semnificativă (adică, p=0,0322).

În plus, ar putea înlocui tratamentul mecanic al spermei hipervâscoase; astfel, aceasta este în mod obișnuit diluată sau trasă într-un ac hipodermic și forțată pentru a depăși vâscozitatea crescută. Deși este puțin probabil ca aceste metode să fie eficiente, deoarece acest tip de tratament crește producția de ROS . În plus, hipervâscozitatea este corelată negativ cu integritatea cromatinei ca decondensare defectuoasă, ceea ce a fost deja observat .

În general, aplicarea DNazei I în tractul respirator a fost deja aprobată medical de către FDA în cazul fibrozei chistice . În plus, DNaza este o componentă naturală a plasmei seminale al cărei rol este probabil diluarea NETs formate în calea reproductivă feminină după recrutarea neutrofilelor ca răspuns la inflamație, iar procedura propusă este potențial aplicabilă din punct de vedere medical în ART. Rolul său este, de asemenea, sporit de faptul că absența sa are efecte adverse asupra inseminării la primate .

Hiperviscozitatea este probabil cauzată fie de inflamație, fie de orice disfuncție a glandelor seminale, deși mecanismul exact nu este clar. Ea ar putea fi asociată cu infecții virale ale tractului genital, așa cum a arătat anterior laboratorul nostru . Au fost aplicate mai multe protocoale terapeutice în vederea reducerii vâscozității materialului seminal, dar rareori rezultatele au fost încurajatoare . Metode precum suprahidratarea și masajul prostatic nu au dat rezultatele scontate. Utilizarea enzimelor proteolitice, cum ar fi alfa-chimotripsina, a dat rezultate dătătoare de speranță, dar utilizarea acesteia nu a fost adoptată .

Într-un alt studiu , DNase I a fost utilizată pentru a reduce vâscozitatea, dar rezultatele finale nu au fost de succes în această privință. Autorii nu au studiat parametrii calitativi ai spermatozoizilor, și anume, motilitatea. În plus, timpul de incubare a fost mult mai mare (o oră) decât cel propus de noi (cincisprezece minute), astfel încât impactul neutru asupra vâscozității ar putea fi atribuit, eventual, incubării prelungite a enzimei cu plasma semenului.

În cele din urmă, în ciuda datelor conform cărora hiperviscozitatea spermei a fost corelată cu inflamația tractului genital masculin, de ex, veziculele seminale, ceea ce a dus la utilizarea antibioticelor și a antioxidanților, aceste forme de terapie au putut trata această afecțiune doar în cazurile în care factorul principal a fost inflamația. De obicei, aceasta este cauzată de diferiți factori care acționează sinergic și, prin urmare, nu există o terapie cauzală directă pentru hiperviscozitate .

La expunerea la stimuli inflamatori, neutrofilele, principala populație de leucocite din materialul seminal, își exercită rolul protector prin inactivarea bacteriilor prin fagocitoză și uciderea ulterioară prin expunerea la enzime proteolitice și ROS. Un al doilea mod de acțiune prin care neutrofilele pot neutraliza agenții patogeni este prin producerea de capcane extracelulare neutrofile (NET) . NETs sunt rețele fibroase tridimensionale, formate în principal din cromatină, care pot prinde și imobiliza microorganismele. S-a demonstrat că NET-urile sunt sensibile la degradarea DNazei, dar nu și a proteazei . Deoarece formarea NET-urilor se bazează pe ADN și s-a demonstrat că DNaza seminală digeră ADN-ul extrudat și eliberează spermatozoizii încurcați, am emis ipoteza că utilizarea DNazei exogene s-ar putea dovedi un tratament valoros în cazurile de hiperviscozitate seminală cauzată în principal de prezența ADN-ului neutrofilic extracelular expus.

Din punct de vedere fiziopatologic, conceptul care atribuie hiperviscozitatea inflamației a fost aproape stabilit. Reacțiile inflamatorii înglobează formarea NET-urilor din neutrofile pentru captarea microorganismelor. Este foarte probabil ca spermatozoizii să consume multă energie încercând să se elibereze de NET-uri și, în consecință, studiul stării de oxidare și apoptoză a acestora este de mare importanță. Mai mult decât atât, „efectul de capcană” care a fost deja descris este o consecință a prevenirii deplasării spermatozoizilor datorită înlănțuirii lor la NET-uri.

În acest studiu, am încercat să lizem ADN-ul extracelular din plasma seminală, care este componenta majoră a NET-urilor, cu DNază I în vederea eliberării acestora din NET-uri și a recuperării parametrilor de calitate a spermatozoizilor, adică motilitatea și morfologia. În plus, după cum arată figura 1, există o diferență semnificativă din punct de vedere statistic între concentrația de WBC și gradul de vâscozitate. Tratamentul propus se limitează la faza de postjaculare și nu la cea clinică. În plus, ipoteza inițială conform căreia vâscozitatea crescută a spermatozoizilor era rezultatul prezenței ADN-ului în spermă a fost verificată, deși sunt necesare studii suplimentare pentru a confirma această ipoteză. Luând în considerare faptul că neutrofilele recrutate formează NET-uri la locurile inflamate, am emis ipoteza că ADN-ul din spermă provine de la neutrofile. Deși nu am prezentat o dovadă directă care să susțină această ipoteză, considerăm că, în conformitate cu cunoștințele noastre, principala sursă posibilă de ADN este cromatina neutrofilelor care este extrudată în condiții de inflamație.

5. Concluzii

Rezultatele studiului nostru susțin concluzia că tratamentul cu DNază I asigură o îmbunătățire semnificativă din punct de vedere statistic a motilității și morfologiei spermatozoizilor. Acesta remediază parametrii de bază ai spermatozoizilor pentru ART, și anume motilitatea și morfologia, numai în cazul spermei hipervizuale. Mai mult, constatările noastre sugerează că o cauză principală a SHV este formarea NET-urilor și propunem astfel potențialul terapeutic și utilitatea acestei abordări.

Date disponibile

Datele utilizate pentru a susține constatările acestui studiu sunt disponibile la cerere la autorul corespondent.

Aprobare etică

Toate procedurile efectuate în acest studiu și care au implicat participanți umani au fost în conformitate cu standardele etice ale Comisiei de Bioetică și Deontologie, Universitatea Națională Kapodistriană din Atena, Facultatea de Medicină, aprobate în ianuarie 2014 (Număr de referință: 1130).

Consimțământ

Toți pacienții și-au dat consimțământul în cunoștință de cauză înainte de implicarea lor în studiu.

Conflicte de interese

Toți autorii declară că nu au interese financiare concurente.

Contribuții ale autorilor

Angelos D. Gritzapis și Vassilis Tsilivakos au conceput studiul. Effrosyni Nosi, Angelos D. Gritzapis și Vassilis Tsilivakos au efectuat achiziția de date, au participat la conceperea acestuia și au redactat manuscrisul. Effrosyni Nosi a efectuat imunoanalizele, iar Angelos D. Gritzapis a efectuat analiza statistică. Effrosyni Nosi, Angelos D. Gritzapis, Konstantinos Makarounis, Georgios Georgoulias, Vasilios Kapetanios, Christodoulos Papanikopoulos, Anastasia Konstantinidou, Panagiotis Venieratos, Marighoula Varla-Leftherioti și Vassilis Tsilivakos au participat la analiza și interpretarea datelor. Toți autorii au citit și aprobat versiunea finală a manuscrisului.

Recunoștințe

Acest proiect a fost finanțat de Laboratorul de Diagnostic Clinic, Locus Medicus S.A.

.