Terapia Genética para Distúrbios Não Herdados

Têm havido muitos avanços na identificação dos mecanismos envolvidos nos danos crônicos de órgãos que abriram caminhos para estudos de terapia gênica . Embora uma infinidade de estudos pré-clínicos e clínicos nas últimas décadas tenha se concentrado no desenvolvimento da terapia genética para doenças hereditárias, apesar de vários estudos pré-clínicos em modelos animais, houve apenas alguns ensaios clínicos que foram realizados para investigar a eficácia terapêutica da terapia genética para doenças não hereditárias. Um estudo recente mostra que a expressão da telomerase utilizando vetores AAV9 exerce efeitos terapêuticos em um modelo de fibrose pulmonar em camundongos. Esta terapia visou a fibrose pulmonar idiopática. Sabe-se que os telômeros atuam como estruturas de proteção nas extremidades dos cromossomos e a presença de telômeros curtos tem se mostrado como uma das causas para o desenvolvimento da doença. Nesta condição, os telómeros tornam-se demasiado curtos, resultando na cessação da divisão celular que, por sua vez, leva à apoptose celular. A telomerase é uma enzima que pode reestruturar o comprimento dos telómeros, e Povedano e colegas desenvolveram um tratamento utilizando o serótipo AAV 9 para fornecer telomerase para corrigir os telómeros curtos. Como a AAV9 visa preferencialmente células alveolares regenerativas tipo II (ATII), os ratos tratados com AAV9-Tert- mostram uma melhor função pulmonar com inflamação e fibrose reduzidas a 1-3 semanas após o tratamento vectorial. É interessante notar que a fibrose pulmonar ou melhorou ou desapareceu com 8 semanas de terapia genética. O tratamento com AAV9-Tert leva a telômeros mais longos e aumento da proliferação de células ATII, bem como menor dano ao DNA, apoptose e senescência.

A terapia com genes cardíacos derivados do vetor AAV está surgindo como uma plataforma inteiramente nova para tratar doenças cardíacas . A terapia genética com AAV para insuficiência cardíaca tem sido validada em estudos pré-clínicos usando modelos animais, e a grande maioria dessas abordagens tem sido empreendida para melhorar o manuseio do cálcio pelos cardiomiócitos. A proteína terapêutica utilizada na maioria destes estudos foi a sarcoplasmática do cálcio ATPase (SERCA2a). Com base nos resultados pré-clínicos positivos, o primeiro ensaio clínico (ensaio CUPID: upregulação do cálcio por administração percutânea do vector genético na doença cardíaca, NCT02346422) foi realizado para administrar SERCA2a usando o vector do sorotipo 1 da AAV para tratar pacientes com insuficiência cardíaca avançada. O resultado deste estudo fase 1 foi bem sucedido sem eventos adversos e avançou para o estudo fase 2a, proporcionando resultados promissores com taxa significativamente baixa de eventos adversos. Entretanto, os resultados do estudo clínico da fase 2b (estudo CUPID2b, NCT01643330) usando o mesmo vetor foram decepcionantes, sem mudança significativa entre o grupo de tratamento e o grupo placebo . O interessante é que há dois novos ensaios futuros com o objectivo de fornecer S100A1 com um vector AAV9 e uma forma constitutivamente activa dos inibidores da proteína fosfatase 1, I1c, com um capsido quimérico com serótipos AAV2 e AAV8 . Além disso, AAV1, AAV6 e AAV9 surgiram como os serotipos AAV mais promissores para a transferência de genes cardíacos, o que proporciona esperanças de abordagens de terapia genética bem sucedidas para tratar a insuficiência cardíaca no futuro.

Abordagens de terapia genética mediadas por AAV para tratar a dor neuropática em roedores também têm sido relatadas . Fischer e colegas mostraram que a administração de rAAV expressando o gene do domínio 3 (CBD3) do canal Ca2+ reduziu significativamente o comportamento da dor, como hiperalgesia após o toque com um pino ou sensibilidade à estimulação da acetona em modelos animais de dor inflamatória e neuropática . Outro estudo utilizando o RNA (shRNA) com codificação do vetor AAV9 contra o receptor vanilóide 1 (TRPV1), que é um gene alvo importante para a dor aguda, demonstrou que a terapia atenuou a alodinia térmica induzida por lesão nervosa (aumento da resposta dos neurônios) 10-28 dias após o tratamento em um modelo de lesão nervosa poupada (SNI) de camundongo. Esses resultados fornecem evidências positivas para encorajar os pesquisadores da terapia genética a desenvolver tratamentos baseados em vetores AAV para pacientes com dor neuropática crônica/diabética.

Considerável progresso tem sido feito na abordagem da terapia genética para tratar a fibrose hepática crônica. Embora os inibidores da enzima conversora da angiotensina (ECA) ou bloqueadores dos receptores da angiotensina (ARBs) sejam amplamente utilizados como tratamentos em pacientes com hipertensão, eles foram testados em pacientes com doença hepática crônica; entretanto, os resultados não foram convincentes principalmente porque produzem efeitos colaterais sistêmicos adversos. Devido à falta de tratamentos médicos, o transplante hepático tornou-se inevitavelmente a única opção para pacientes com doença hepática em estágio final, resultante de fibrose hepática crônica e/ou cirrose hepática. Além disso, a crescente incidência de doença hepática crônica, a falta de órgãos doadores, complicações pós-transplante e o alto custo do transplante hepático significam que há uma grande necessidade de descobrir e formular novas terapias específicas, eficazes, seguras e baratas para fibrose hepática/cirrose hepática.

Uma abordagem possível para contornar esta situação é desenvolver estratégias antifibróticas direcionadas aos órgãos. Estudos de nosso laboratório sugeriram que um possível alvo é o “eixo alternativo” do sistema renina-angiotensina (RAS), compreendendo sua enzima chave angiotensina conversora da enzima 2 (ACE2), que decompõe o potente octapéptido profibrótico, angiotensina II (Ang II) em um heptapéptido antifibrótico, angiotensina-(1-7) (Ang-(1-7)) . Evidências de estudos experimentais com animais mostraram que a ACE2 recombinante humana (rhACE2) é benéfica para a prevenção da hipertensão arterial em doenças cardiovasculares e para melhorar a função renal em nefropatia diabética . Curiosamente, a rhACE2 foi bem tolerada por um grupo de voluntários humanos saudáveis em um ensaio clínico de fase 1, sem exercer quaisquer efeitos colaterais cardiovasculares indesejados . Há um estudo que relatou efeitos terapêuticos da ECA2 recombinante na fibrose hepática experimental, em que a lesão hepática foi induzida cirurgicamente pela colestase ou pela injeção de tetracloreto de carbono hepatotóxico . Eles demonstraram que a ECA2 recombinante reduziu significativamente a fibrose hepática em ambos os modelos animais de doença hepática . No entanto, uma grande desvantagem desta abordagem sistêmica é que o tratamento inevitavelmente produz efeitos fora do alvo, que em muitos casos são indesejáveis. Assim, há várias desvantagens na administração sistêmica da ECA2 recombinante. Isto inclui injecções diárias de ECA2, um procedimento que é invasivo num ambiente clínico e uma abordagem dispendiosa com efeitos indesejáveis na regulação da tensão arterial . Para contornar este problema, uma abordagem ideal seria aumentar os níveis de ACE2 específicos dos tecidos no órgão alvo. Assim, espera-se que o aumento da actividade da ACE2 em órgãos específicos usando um vector recombinante específico do fígado, produza efeitos terapêuticos confinados ao órgão alvo enquanto minimiza os efeitos indesejados fora do alvo.

Além do uso do serótipo capsid específico do fígado, a especificidade pode ser ainda mais reforçada através da engenharia do vector com o gene ACE2 sob o controlo transcripcional de um forte promotor específico do fígado, a apolipoproteína E/humana α1-antitripsina. Estudos publicados por nosso laboratório utilizaram um vetor AAV pseudotipado específico do fígado (rAAV2/8) para avaliação pré-clínica e descobriram que a superexpressão hepática do gene murino ACE2 entregue aos ratos durou até 6 meses após uma única injeção intraperitoneal. Em seguida, tratamos ratos com uma série de modelos de doenças hepáticas, que incluíam fibrose biliar induzida por ligação do ducto biliar (BDL), lesão tóxica induzida por injeções de tetracloreto de carbono (CCl4), e fibrose hepática gorda associada à fibrose hepática induzida pela alimentação com metionina e colina deficiente (MCD) com uma única injeção intraperitoneal de rAAAV2/8-ACE2 . O tratamento produziu um grande aumento da expressão da ACE2 e da atividade proteica, que foi confinada ao fígado sem afetar outros órgãos importantes. Ao contrário das doenças hereditárias, por exemplo, hemofilia B onde um nível relativamente baixo de expressão de transgene no fígado pode ser suficiente para pequenos aumentos subsequentes nos níveis de FIX no sangue , a magnitude da expressão de transgene necessária para intervenção terapêutica em doenças não hereditárias pode ser substancialmente maior. Isto, por sua vez, pode representar um desafio para os pesquisadores da terapia genética. Curiosamente, contudo, na nossa abordagem terapêutica hepática com rAAV2/8-ACE2, descobrimos que o aumento da expressão da ECA2 hepática reduziu o nível hepático de Ang II profibrótico em mais de 50% em comparação com aqueles tratados com um vector de controlo que transportava albumina sérica humana (rAAV2/8-HSA). Uma redução do Ang II, que foi acompanhada por aumentos nos níveis hepáticos do peptídeo Ang-(1-7) antifibrótico, resultou numa redução acentuada da expressão inflamatória das citocinas, levando a uma redução profunda da fibrose hepática em todos os três modelos (Figura 2) . Estes estudos com modelos animais de curto prazo foram validados para fornecer evidências de que em modelos animais de longo prazo de fibrose biliar e doença hepática gordurosa, que produzem lesões hepáticas mais comparáveis àquelas observadas em pacientes com tais doenças, uma única injeção intraperitoneal de rAAV2/8-ACE2 causou uma redução profunda na fibrose hepática (Figura 3). Em contraste marcante com outros estudos que utilizaram vetores AAV, verificamos que o rAAV2/8-ACE2 reduziu os níveis séricos de transaminase alanina (ALT) em animais doentes em comparação com aqueles que receberam o vetor controle (rAAV2/8-HSA), sugerindo que o próprio vetor é seguro no fígado. Além disso, rAAV2/8-HSA (até 10 dias) ou rAAAV2/8-ACE2 (até 24 semanas) vetor injetado em ratos saudáveis não produziu nenhuma alteração no nível de ALT plasmático, confirmando que o próprio vetor é improvável de causar lesão hepática. A representação esquemática do mecanismo molecular associado à terapia do gene ACE2 usando o vetor rAAV2/8 na fibrose hepática é mostrada na Figura 4.

O fornecimento de genes ao fígado usando o vetor rAAV2/8 mostrou ser terapêuticamente promissor no fígado adulto, mas seus efeitos não foram extensivamente investigados no fígado imaturo. Embora o rAAV2/8 transduza o fígado neonatal de camundongos com alta eficiência, o vetor não é persistente no fígado e decresce rapidamente com o crescimento do fígado. Portanto, o uso bem sucedido da terapia mediada pelo rAAAV2/8 para tratar doenças hepáticas na primeira infância pode requerer readministração. Em linha com isto, outro estudo demonstrou que o tratamento da transcarbamilase de ornitina (OTC) – ratos neonatais deficientes com terapia AAV2/8-OTC – não conseguiu proteger os ratos da hiperamonemia na idade adulta. Assim, produzir transdução estável no fígado em desenvolvimento continua sendo um dos maiores desafios para a terapia genética rAAV2/8 específica do fígado, e a readministração de vetores pode ser necessária para manter a eficácia terapêutica na vida adulta após o tratamento neonatal precoce.

Embora os vetores AAV empregados para estudos pré-clínicos possam ser eficazes no fígado humano, é importante selecionar um vetor AAV específico para hepatócitos humanos com maior eficiência de transdução . Recentemente, dois grupos propuseram o uso de camundongos humanizados, como o modelo de rato Fah-/-/Rag2-/-/Il2rg-/-, para identificar o melhor serótipo rAAV para a terapia genética hepática. Os estudos em modelos de camundongos humanizados repovoados com mais de 25% de hepatócitos humanos permitiram aos pesquisadores identificar vetores de AAV específicos do fígado humano, como o LK-03 derivado da biblioteca de AAV com DNA removido por capsidro. Esta biblioteca foi gerada usando 10 genes de AAV capsid. O LK-03, que é composto de cinco diferentes capsids de AAV parentais, foi capaz de transduzir hepatócitos humanos primários com maior eficiência in vitro e em um modelo de xenoenxerto de carcinoma hepatocelular em vivowhen comparado ao sorotipo 8 de AAV. Wang e colegas também relataram um nível mais alto de transdução hepática em camundongos FRG usando capsid AAVrh10, um clade E AAV derivado de rhesus macaque, e AAV3B e mostraram que os vetores AAV-LK-03 podem ser superiores a AAV3B ou AAV8 . Espera-se que os pesquisadores usem cada vez mais modelos animais humanizados para outras doenças além da doença hepática, o que lhes permitirá identificar novas variantes de vetores AAV projetados, eficiência de transdução e reações imunológicas específicas para o tecido humano sob investigação. Além disso, foi relatado que o vetor AAV3B-eGFP, que foi capaz de causar expressão de GFP robusta específica do fígado nos fígados de primatas não humanos, é significativamente melhor que o AAV8 sem hepatotoxicidade aparente .