Abstract

O objectivo deste estudo foi investigar o papel dos ácidos orgânicos produzidos pela Exiguobacterium sp. estirpe 12/1 (DSM 21148) na neutralização de águas residuais alcalinas emanadas da indústria de bebidas. Esta bactéria é conhecida por ser capaz de crescer em meio de pH tão alto quanto pH 12,0 e neutralizar águas residuais industriais alcalinas de pH 12,0 a pH 7,5. A investigação inicial sobre o tipo de grupos funcionais presentes no meio, realizada por espectroscopia FT-IR, revelou a presença de picos correspondentes ao grupo carbonila e grupo hidroxila, sugerindo a liberação de ácido carboxílico ou produto(s) metabólico(s) relacionado(s). A identificação do grupo carboxílico específico, realizada por RP-HPLC, revelou a presença de um único pico no sobrenadante de cultura com tempo de retenção mais semelhante ao ácido fórmico. A concentração de ácido produzido em diferentes fontes de carbono foi estudada em função do tempo. Embora o ácido estivesse presente na mesma concentração final, a taxa de produção de ácido foi maior no caso do meio suplementado com sacarose seguido por frutose e glicose. O conhecimento dos produtos metabólicos da bactéria pode ser considerado como um primeiro passo para a realização do seu potencial de biorremediação em larga escala de águas residuais alcalinas da indústria de bebidas.

1. Introdução

Microorganismos alcalino-microbianos com pH óptimo para crescimento a pH 9 ou superior, têm tido um grande impacto em aplicações industriais. Os detergentes biológicos contêm enzimas, tais como celulases alcalinas e/ou proteases alcalinas, que foram produzidas a partir de alcaliníferas. Os alcalifílicos também têm sido utilizados para a produção industrial de enzimas para que possam ser de uso específico, por exemplo, a ciclodextrina por ciclomaltodextrina glucanotransferase alcalina e a maltohexase alcalina activa α-amilase que encontram aplicação nas indústrias alimentícia, química e farmacêutica. Tem sido relatado que a pasta de madeira tratada com álcali pode ser biologicamente branqueada por xilanases produzidas por alcaliníferas. Fujiwara e colegas de trabalho relataram o uso de uma protease alcalina para decompor o revestimento gelatinoso de filmes de raios X, do qual a prata foi recuperada. Os alcalifílicos também provaram seu potencial na biodegradação de uma variedade de compostos orgânicos .

Assim, as bactérias alcalifílicas atraíram muito interesse devido às suas enzimas extracelulares e propriedades bioquímicas como a estabilidade alcalina e alcalina. A sua bioenergética também tem sido investigada com algum detalhe, enquanto que pouco se sabe sobre a sua fisiologia, por exemplo, enzimas intracelulares e metabolitos. As características do processo metabólico intermediário são importantes, pois ajudam a caracterizar a bactéria, sua composição enzimática, o estágio metabólico das células e as possibilidades da engenharia metabólica. A capacidade dos alcalifílicos de flutuar fortemente o pH do meio contendo carboidrato foi explorada em trabalhos anteriores para neutralização de águas residuais altamente alcalinas emanadas da indústria de bebidas usando a cepa Exiguobacterium sp. 12/1 . Genus Exiguobacterium pertence à ordem Bacillales que também inclui membros do gênero Bacillus. Exiguobacterium sp. 12/1 é um alcalífero facultativo que cresce optimamente a pH 10 e é capaz de neutralizar águas residuais alcalinas para as fazer descer de pH 12,0 para pH 7,5. Supõe-se que a bactéria libera algum produto(s) metabólico ácido(s) a fim de neutralizar o meio externo altamente alcalino. Entretanto, é importante caracterizar o tipo de metabólitos liberados no meio extracelular. Aqui, estudamos a produção de ácidos orgânicos como um possível mecanismo de neutralização de álcalis. Tais tipos de estudos serão necessários antes que as aplicações em larga escala da bactéria para neutralização de águas residuais alcalinas da indústria de bebidas possam ser desenvolvidas.

A principal fonte de carbono nas águas residuais da indústria de refrigerantes é a sacarose (dissacarídeo contendo glicose e frutose), que também é o maior contribuinte para a sua demanda bioquímica de oxigênio (DBO). A DBO média das águas residuais da indústria de refrigerantes varia de 600 a 4500 mg/L, o que equivale a 673-5052 ppm de sacarose. Uma pesquisa bibliográfica sobre os produtos metabólicos de um grande número de bactérias que crescem com açúcares simples sugere que as bactérias poderiam estar utilizando esses açúcares simples para gerar ácidos orgânicos. Isto é ainda corroborado pela análise de produtos metabólicos extracelulares de outras espécies de Bacillus alcalifílicos. O principal ácido orgânico produzido na fonte de carbono sacarose nestes estudos foi encontrado como ácido acético. O ácido fórmico é um metabolito comum de bactérias neutrófilas em condições anaeróbias, enquanto B. circulans var. alkalophilus produz até 2 g/L dele mesmo em culturas aeróbias. Outros ácidos voláteis como propiónico, butírico, isobutírico e isovalérico são típicos para estirpes Bacillus alcalophilus ssp. halodurans, B. alcalophilus, e Bacillus sp. 17-1. Os ácidos isobutírico e isovalérico têm sido relatados na mídia de vários bacilos neutrofílicos. Mas estes ácidos, assim como os ácidos propiónico e butírico, são considerados originários de aminoácidos baseados em estudos sobre o Clostridium sp. . Os ácidos láctico e pirúvico são comumente produzidos por bacilos neutrófilos, mas a produção de ácido succínico por Bacillus é rara. O etanol não foi detectado em bacilos alcalifílicos, embora seja um produto típico de culturas de glicose de muitos bacilos neutrofílicos. Assim, as condições de crescimento alcalino podem afetar a produção dos metabólitos neutros . Neste estudo temos utilizado cromatografia líquida de fase reversa de alto desempenho para estudar o tipo e concentração dos ácidos produzidos pela estirpe 12/1 de Exiguobacterium sp. durante a neutralização de meio de pH elevado contendo diferentes tipos de fontes de carbono.

2. Materiais e Métodos

2.1. Condições de Estirpe e Cultura

A cultura Exiguobacterium sp. 12/1 foi obtida da DSMZ (DSM 21148) e foi mantida como estoques de glicerol. Meio alcalino basal (ABM) contendo (todas as concentrações em g/L): peptona, 1; extrato de levedura, 0,5; glicose, 1; K2HPO4, 0,1; Na2CO3, 1; pH 10 (os três últimos componentes adicionados ao meio autoclavado a partir de soluções esterilizadas separadamente) foi utilizado para o cultivo de rotina da linhagem 12/1 a 37°C. Para análise IR e RP-HPLC, a bactéria foi cultivada a 37°C, 200 rpm em meio mínimo salino (MSM) contendo (todas as concentrações em mM): K2HPO4, 10; KH2PO4, 10; MgSO4-7H2O, 1; EDTA sal dissódico, 0.3; ZnSO4-7H2O, 0.01; MnSO4, 0.02; CuSO4-5H2O, 0.004; FeSO4-7H2O, 0.1; NaMoO4-2H2O, 0.004; (NH4)2SO4, 5 e 1% (p/v) de um dos seguintes carboidratos: glicose, frutose ou sacarose (todos os componentes adicionados a partir das soluções concentradas autoclavadas separadamente). O pH final do meio foi ajustado para 10,5 usando 1 N NaOH.

2,2. Análise de Crescimento e Cultura pH

1 mL de cultura em fase de log em ABM foi usado para inocular as culturas pré-cultura (50 mL) (MSM contendo 1% de açúcar). A cultura de teste real (250 mL de MSM em frasco de 500 mL de Erlenmeyer) foi inoculada com pré-cultura inteira na fase de meio de ciclo (D.O. ~ 1,2). Cada conjunto de cultura consistiu em três frascos. A absorvância das amostras a 650 nm foi utilizada como medida de crescimento bacteriano. O pH foi determinado em amostras de cultura sem células à temperatura ambiente após centrifugação 4000 ×g durante 20 min.

2,3. Análise FT-IR

Cultura foi colhida após 60 h de crescimento e foi centrifugada a 4000 ×g durante 20 min.

2,3. Para análise IR, o sobrenadante de cultura foi liofilizado e triturado em forma de pó. O sobrenadante em pó foi então misturado com brometo de potássio, e a mistura foi prensada em comprimidos. Finalmente, o comprimido foi analisado usando o espectrômetro FT/IR-4200 (JASCO, Tóquio, Japão).

2.4. Análise RP-HPLC

Cultura foi colhida em diferentes pontos de tempo e centrifugada a 4000 ×g durante 20 min. Para análise por HPLC o sobrenadante de cultura foi filtrado através do filtro 0,22 μm, e 10 μL da amostra filtrada foi injetada na coluna de HPLC.

Ácido fórmico de grau padrão analítico, ácido acético, ácido succínico, ácido propiônico, ácido láctico e ácido isobutírico foram obtidos da Sigma. Soluções padrão de estoque (100 mg/mL ou 100 μL/mL) foram preparadas e foram armazenadas a 4°C para uso posterior. Soluções padrão de trabalho (10 mg/mL ou 10 μL/mL) foram preparadas diariamente. Milli-Q água (Millipore) foi utilizada para preparar soluções tampão e de estoque de cada composto e amostras. As soluções de reserva, amostras e tampão foram filtradas através de filtros de membrana de celulose Whatman (0,45 μm, Whatman, Clifton, NJ, EUA). Os solventes foram desgaseificados sob vácuo antes do uso.

A análise do ácido orgânico foi feita de acordo com o método de Tormo e Izco . A análise foi realizada em um Breeze System (Waters, Mildford, MA, EUA) composto por uma bomba HPLC binária de 1525, um amostrador automático de 717 mais, e um detector UV de dois canais de 2487 ajustado a 210 nm, operado usando um software Breeze. A separação foi realizada em uma coluna Atlantis dC18 (Waters) 250 × 4,6 × 5 μm. 20 mM de NaH2PO4 ajustado a pH 2,20 com ácido fosfórico foi preparado diariamente e filtrado através de 0,2 μm membranas hidrofílicas (Millipore). O programa de solvente utilizou dois reservatórios contendo 1% de acetonitrilo em tampão fosfato 20 mM ajustado para pH 2,20 com ácido fosfórico (Solvente A) e acetonitrilo (Solvente B); a vazão foi ajustada para 1,5 mL/min à temperatura ambiente. O programa de gradiente começou com 100% do solvente A e após 7 min o Solvente B foi aumentado linearmente para chegar a 7% em 5 min. De 12 a 19 min a taxa foi mantida em 93% do Solvente A e 7% do Solvente B. Depois disso a taxa foi alterada para as condições iniciais para equilibrar a coluna por 15 min antes de injetar novamente 10 μL da próxima amostra.

3. Resultados

3.1. Análise de Neutralização em Meio Definido

Meio Salino Mínimo foi selecionado para a análise do ácido orgânico produzido pela bactéria devido à sua natureza definida e fonte de carbono similar às águas residuais da indústria de bebidas. A bactéria foi autorizada a crescer em meio mínimo de sal suplementado com diferentes fontes de carbono glicose, frutose e sacarose. A Figura 1 mostra o perfil de crescimento e as características do pH do meio com o tempo. A frutose e a sacarose produziram uma neutralização muito mais rápida do meio em comparação com a glicose. O pH final obtido com a glicose também foi ligeiramente superior ao obtido no caso do meio com sucrose e fruticultura. Isto também se reflete no perfil de crescimento da bactéria cultivada nas três fontes de carbono. As bactérias cresceram mais rapidamente na sacarose seguida de frutose e glicose.

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Figura 1

Variação no pH (a) e O.D. (b) com o tempo em HSH. Os valores representam a média de três medidas replicadas, e as barras de erro representam o desvio padrão.

3.2. Identificação do grupo funcional presente no sobrenadante de cultura

Para identificar o grupo funcional amplo do metabolito produzido pela bactéria a fim de neutralizar as águas residuais alcalinas, o sobrenadante de cultura liofilizada foi submetido à espectroscopia FT-IR. Dois picos correspondentes ao grupo carbonilo (em 1644,98 cm-1) e grupo hidroxila (em 3436,74 cm-1) estavam presentes no espectro (Tabela 1). De acordo com a pesquisa da literatura, a bactéria muito provavelmente produz ácidos orgânicos como um produto metabólico que neutraliza as águas residuais alcalinas.

3.3. Identificação do Produto Metabólico Específico da Bactéria

Para identificar o ácido orgânico produzido pela bactéria, a fase reversa do HPLC foi realizada utilizando padrões conhecidos de ácido orgânico selecionados após pesquisa bibliográfica. Os padrões foram executados tanto individualmente (Figura 2(a)) quanto em mistura (Figura 2(b)), a fim de verificar quaisquer diferenças no tempo de retenção decorrentes da interferência de outros ácidos orgânicos no meio. O RT de ácidos orgânicos padrão nos dois casos foi encontrado similar com a diferença no tempo de retenção não excedendo 0,09 unidades, exceto para o ácido propiônico (Tabela 2). O sobrenadante da cultura foi analisado pelo mesmo método e foi considerado como compreendendo um único pico com tempo de retenção semelhante ao ácido fórmico. Isto foi ainda confirmado pelo pico do sobrenadante com ácido fórmico padrão cujo pico se sobrepôs ao do produto em sobrenadante (Figura 2(d)).

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Figura 2

RP-Cromatogramas HPLC de ácidos orgânicos padrão individual (a), ácidos orgânicos padrão em mistura (b), sobrenadante de cultura (c), e sobrenadante de cultura com ácido fórmico.

3.4. Análise Quantitativa do Produto Metabólico da Bactéria

Para a análise quantitativa do sobrenadante de cultura, diferentes concentrações padrão de ácido fórmico foram executadas, e a área de pico correspondente a cada concentração foi calculada. A área dos picos foi plotada em relação à concentração a fim de se obter uma curva padrão (Figura 3). Essa curva padrão foi usada para calcular a quantidade de ácido produzida com o tempo em meio mínimo de sal suplementado com diferentes fontes de carbono. O sobrenadante de cultura da bactéria foi analisado de forma dependente do tempo e foi novamente submetido à análise de HPLC de fase reversa. Verificou-se que o pico do produto principal do sobrenadante da cultura bacteriana aumenta com o tempo. O tempo de retenção do ácido é semelhante ao do ácido fórmico. O estudo do ácido fórmico produzido com diferentes fontes de carbono em função do tempo é mostrado na Figura 4. A maior quantidade de ácido foi produzida no caso de HSH suplementado com sacarose seguida por frutose e glicose.

Figura 3

Curva padrão para a determinação da concentração de ácido fórmico no sobrenadante da cultura.
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Figura 4

Variação na quantidade de ácido orgânico produzido com o tempo em HSH suplementado com diferentes fontes de carbono. Os valores representam a média de três medições replicadas, e as barras de erro representam o desvio padrão.

4. Discussão

A maior fonte de carbono no efluente da indústria de bebidas é a sacarose. Portanto, para a análise do produto metabólico produzido durante a neutralização, foi selecionado um meio salino mínimo bem definido contendo sacarose e os dois monossacarídeos constituintes – açúcares-glucose e frutose. As características de crescimento da estirpe 12/1 em meio mínimo de sal suplementado com as três fontes de carbono mostram neutralização eficiente concomitante com o crescimento (Figuras 1(a) e 1(b)). A diminuição do pH do meio de crescimento é necessariamente devido à formação de ácidos ou à remoção de bases.

A produção de ácidos é bem documentada no caso de bactérias cultivadas em açúcares simples. Os produtos metabólicos de alguns membros alcalifílicos do gênero Bacillus têm sido estudados . O principal ácido orgânico produzido na fonte de carbono sacarose nestes estudos foi encontrado como sendo ácido acético. As sequências genómicas das espécies de bacilos alcalifílicos – Bacillus pseudofirmus OF4, Bacillus halodurans, e Bacillus clausii- também apoiam esta observação, uma vez que todas estas espécies têm uma via funcional de conversão de piruvato em acetato. O ácido fórmico é um metabolito comum de bactérias neutrófilas em condições anaeróbias, enquanto B. circulans var. alkalophilus produz até 2 g/L dele mesmo em culturas aeróbias. Outros ácidos voláteis tais como propiónico, butírico, isobutírico e isovalérico são típicos para estirpes Bacillus alcalophilus ssp. halodurans, B. alcalophilus e Bacillus sp. 17-1. Os ácidos isobutírico e isovalérico têm sido relatados na mídia de vários bacilos neutrofílicos. Mas estes ácidos, assim como os ácidos propiónico e butírico, são considerados como originários de aminoácidos baseados em estudos sobre o Clostridium sp. . Os ácidos láctico e pirúvico são comumente produzidos por bacilos neutrófilos, mas a produção de ácido succínico pelo Bacillus é rara. O etanol não foi detectado em bacilos alcalifílicos, embora seja um produto típico de culturas de glicose de muitos bacilos neutrofílicos. Assim, as condições de crescimento alcalino podem afetar a produção dos metabólitos neutros .

Os estudos iniciais sobre os produtos metabólicos no caso do bacilo sp. tinham sido realizados utilizando o procedimento titrimétrico . O aumento da capacidade tamponante do sobrenadante da cultura bacteriana em torno do pH 5, que é a faixa típica de protonação dos ácidos carboxílicos, foi utilizado para levantar a hipótese de que o meio contém ácidos carboxílicos. Neste estudo, utilizamos a espectroscopia FT-IR para verificar o grupo funcional do(s) composto(s) presente(s) no sobrenadante da cultura. O espectrógrafo FT-IR mostrou os picos característicos do grupo carbonilo (a 1644,98 nm) e do grupo hidroxila (a 3436,74 nm) (Tabela 1) o que sugere a presença de uma espécie química constituída pelo grupo hidroxila e carbonila e com maior probabilidade de ser ácido carboxílico.

O método HPLC de fase reversa foi utilizado para analisar os ácidos orgânicos presentes no sobrenadante da cultura. As condições de HPLC foram escolhidas para a melhor resolução relatada, ou seja, pH 2,2 e 1% de acetonitrilo. O método de HPLC de fase reversa é vantajoso devido à utilização de colunas mais baratas, manipulação mais fácil dos parâmetros analíticos para otimizar a separação e as análises à temperatura ambiente. O método foi primeiramente utilizado para calcular o tempo de retenção dos padrões ácidos escolhidos de acordo com a pesquisa da literatura. A ordem de eluição dos ácidos nestas condições foi a mesma relatada em Tormo e Izco , mas houve variação nos tempos de retenção observados neste estudo e os relatados em Tormo e Izco . Esta variação pode ser atribuída à diferença nas condições de HPLC como temperatura de 25-30°C neste estudo versus 24°C ± 1°C relatados em Tormo e Iczo .

O RP-HPLC do sobrenadante de cultura mostra a presença de um único pico com absorvância a 211 nm que é o comprimento de onda de absorção característico dos ácidos orgânicos. Assim, o sobrenadante contém uma única espécie química que é muito provavelmente ácido orgânico. A comparação do tempo de retenção deste pico e o tempo de retenção dos ácidos orgânicos padrão mostra que o tempo de retenção é mais semelhante ao ácido fórmico. Esta observação foi ainda confirmada pelo pico de ácido fórmico no sobrenadante da cultura que aumenta a área do pico do produto (Figuras 2(c) e 2(d)). A presença de ácido fórmico no sobrenadante em cultura está de acordo com os produtos metabólicos de alguns membros alcalifílicos do gênero Bacillus, bem como de algumas bactérias alcalíferas anaeróbicas sacarolíticas, como Halonatronum saccharophilum, Amphibacillus fermentum, e Amphibacillus tropicus .

A diminuição máxima de unidades de pH que ocorre por unidade de tempo relatada até agora nas bactérias alcalífilas é de 0,13 unidades por hora no caso de Bacillus circulans var. alkalophilus que é bastante baixa em comparação com a diminuição de mais de duas unidades durante a 1 h inicial de inoculação relatada neste estudo. A grande diminuição do pH indicou uma formação de produtos de catabolismo ácido. No entanto, a taxa de diminuição do pH por si só não indica o aumento da concentração de ácidos . Portanto, a análise quantitativa do produto metabólico da bactéria foi realizada utilizando RP-HPLC. A HPLC foi preferida em relação à GC como comparação dos métodos de GC e HPLC para determinação de ácidos orgânicos em sobrenadantes de bactérias alcalófilas em cultura sugere que enquanto a resolução dos ácidos por GLC foi excelente, a reprodutibilidade quantitativa por HPLC foi melhor que a GLC . Como esperado, a concentração de ácidos produzidos aumentou com o aumento do tempo de incubação (Figura 4). De fato, a quantidade de ácido continuou a aumentar muito após o pH mínimo ter sido atingido. Isto está de acordo com os estudos anteriores de produção ácida no caso do Bacillus sp. alcalifílico facultativo e obrigatório, onde a produção ácida continuou a aumentar mesmo 30 h após o pH mínimo ter sido alcançado. A análise comparativa do produto metabólico produzido em meio suplementado com diferentes fontes de carbono mostra que, embora ácido estivesse presente na mesma concentração final, a taxa de produção ácida foi maior no caso de meio suplementado com sacarose seguido por frutose e glicose (Figura 4). Isto está de acordo com as características de crescimento do organismo no meio suplementado com estes açúcares.

5. Conclusão

Exiguobacterium sp. cepa 12/1 neutraliza o pH do meio externo pela produção de ácido orgânico de cadeia curta ácido fórmico. Tendo em vista a potencial aplicação da biorremediação em larga escala de águas residuais alcalinas, esta capacidade de neutralização alcalina da bactéria para águas residuais da indústria de bebidas pode ser considerada como um primeiro passo para a exploração do seu potencial de comercialização.

Conhecimento

N. M. Kulshreshtha reconhece a bolsa de pesquisa da Comissão de Bolsas Universitárias. Os autores são imensamente gratos ao Conselho de Pesquisa Científica e Industrial, Índia, por fornecer uma plataforma R&D e instalações para esta pesquisa.