γδ-selecção

γδT células emergem de timócitos DN, à medida que o rearranjo das cadeias TCRγ e δ ocorre nos estádios DN . γδ células precursoras, que têm TCRγ e δ rearranjadas antes da recombinação de TCRβ, expressam γδTCR/CD3 complexo na membrana plasmática, onde γδTCR auto-oligomeriza, como a pré-TCR, e inicia vias de sinalização intracelular . Este sinal γδTCR induz o processo referido como “γδ-selection”, que confirma a geração de cadeias funcionais TCRγδ, fazendo a célula reconhecer que “I am a γδT cell” .

O sinal γδ-selection desencadeia a diferenciação das células precursoras CD5- CD24high γδ para as células CD5+ CD24low γδT-commitadas . A transição de células CD5- para CD5+ γδT é acentuadamente prejudicada nos ratos Syk-deficient, enquanto os ratos Zap70-deficient exibem a diferenciação normal das células CD5+ γδT. Os ratos Zap70/Syk duplamente deficientes exibem uma parada completa da diferenciação celular de γδT na fase de CD5- precursor . Assim, a selecção de γδ depende principalmente do sinal Syk-mediated, e Zap70 desempenha apenas um papel menor e redundante neste processo. Este mecanismo é bastante análogo ao da selecção de β. Um alvo crítico do Syk no sinal de seleção γδ é o Lat signalosome, já que ratos com deficiência de Lat exibem completa inibição da seleção γδ e uma total falta de células maduras γδT .

γδ células precursoras de ratos com deficiência de Syk/Zap70 ou ratos com deficiência de Lat são indistinguíveis das células da linhagem αβT pela expressão de suas proteínas da superfície celular, exceto para o γδTCR, e ainda mantêm o potencial de se diferenciar em células αβT. O que determina o destino da diferenciação na linhagem αβT ou γδT a partir do precursor? Esta questão foi abordada por estudos utilizando ratos transgênicos do γδTCR. Quando o sinal γδTCR é enfraquecido por uma deficiência de proteínas sinalizadoras ou de ligandos endógenos para o transgênico γδTCR, as células precursoras deram origem às células DP da linhagem αβT, às custas das células da linhagem γδT . Esses resultados sugerem que um sinal mais forte (provavelmente na interação com γδTCRligand) leva ao comprometimento com as células de γδT, enquanto um sinal mais fraco (provavelmente por pré-TCR independente de ligantes) leva à diferenciação de αβT. Entretanto, experimentos usando outra linhagem de camundongos transgênicos expressando γδTCR com a mesma especificidade de ligantes demonstraram que as células γδT eram capazes de amadurecer na ausência dos ligandos . Chien e colaboradores empregaram um método de coloração tetramérica para identificar a população celular específica do ligante γδT a fim de examinar a importância dos ligandos endógenos γδTCR em camundongos não-transgênicos. Os resultados mostraram claramente que o número de células específicas do ligante γδT era comparável entre os ratos com ligantes suficientes e deficientes, sugerindo que a maioria das células do γδT não encontrou ligantes durante a diferenciação tímica. Os autores também forneceram evidências de que alguns γδTCRs podem sinalizar ligandindependentemente . Estas observações contradizem evidentemente o modelo anterior, segundo o qual o compromisso da linhagem γδT requer a interação ligand γδTCR. Considerando que células policlonais do γδT reagem a certos ligandos exógenos diferenciados e funcionalmente maduros no timo, é provável que as observações em certas linhas de camundongos transgênicos do γδTCR não reflitam a maioria das células do γδT com o policlonal γδTCRs.

Para examinar o impacto do sinal de seleção γδ sobre a diferenciação em γδT/γδT, utilizamos ratos com deficiência de Lat, em que a diferenciação das células de γδT é presa no estágio CD5- precursor. γδTCR+ células precursoras foram purificadas de ratos adultos com Lat-deficiente, infectados com retrovírus expressando Lat, e cultivadas em monocamadas de células estromais (Fig. 2a). Esta experiência permite a avaliação direta do fenótipo celular antes e depois da seleção do γδ em uma condição livre de ligaduras. Em comparação com células de controle não transduzidas, as células Lat-expressas γδT apresentaram uma indução marcada da expressão superficial do CD5 (Fig. 2b), assim como a expressão do mRNA dos genes de assinatura celular γδT (Tcrd, Egr3, Runx3 e Bcl-2), e a revogação completa da transcrição dos genes associados às células DN precursoras e às células αβT (Rag1, Rag2 e Ptcra) (Fig. 2c). Estes resultados indicam que o sinal γδTCR tanto conduz à diferenciação em direção à linhagem γδT como reprime a diferenciação na linhagem αβT de forma liga-independente.

Encastrados juntos, embora os mecanismos ainda sejam elusivos (e debatidos) pelos quais a pré-TCR e γδTCR direcionam os processos de diferenciação para as linhagens αβT e γδT, respectivamente, é provável que a seleção γδ, pelo menos na maioria das células naturalmente geradas γδT, não esteja dependente do ligante cognato γδTCR no timo.

γδTCR a força do sinal determina a diferenciação γδT17/γδT1

Durante o desenvolvimento das linhagens αβT e γδT, a expressão de Syk e Zap70 é regulada inversamente: Syk é altamente expresso nos estágios iniciais (DN1-3 e precursor γδ) e desregulado depois, enquanto Zap70 é expresso nos estágios posteriores (após a seleção de β ou γδ-seleção) . γδT células que passaram por γδ-seleção expressam altos níveis de Zap70, bem como complexos γδTCR/CD3 e podem responder a ligandos endógenos se forem fornecidos no timo. Actualmente reconhece-se que, ao contrário das células αβT, as células γδT não são submetidas a uma selecção positiva ou a uma eliminação clonal no timo. Vários estudos sugeriram que a interacção ligand de γδTCR no timo controla a função effector das células de γδT.

Usando a coloração tetramérica de uma população celular de γδT que é reativa às moléculas não clássicas de MHC classe I T10 e T22, o grupo de Chien descobriu que células de γδT com antígenos que se desenvolveram na ausência dos ligandos produziram preferencialmente IL-17, enquanto que células de γδT com experiência em antígenos que se desenvolveram na presença dos ligandos produziram predominantemente IFNγ . Este estudo sugeriu primeiramente a idéia de que um sinal forte induzido pelos ligantes γδTCR e um sinal fraco γδTCR induzem células γδT1 e γδT17, respectivamente. Um estudo recente com camundongos deficientes T10/T22 recentemente gerados relatou essencialmente os mesmos resultados, apoiando este “modelo de força de sinal” . Este modelo tem sido ainda apoiado por outros estudos. A maturação tímica e a diferenciação dos efeitos das células Vγ5Vδ1 γδT requerem Skint1 (e provavelmente outras proteínas da família Skint), uma suposta proteína costimulatória para a Vγ5Vδ1 TCR . Na ausência do Skint1, Vγ5Vδ1 γδT células são desviadas para um fenótipo de células γδΤ17 em detrimento do fenótipo de células γδΤ1 . Além disso, o desenvolvimento celular de γδT1 também requer co-estimulação via CD27, uma proteína da superfamília receptora de TNF expressa em células de γδT1, mas não em células de γδT17 . Mais recentemente, o grupo de Pennington identificou células tímicas bipotentes γδT (CD24lo CD44lo CD45RBlo) que podem dar origem tanto a células γδT17 como a células γδT1. Na cultura de órgãos do timo fetal, o desenvolvimento de células γδT17 foi inibido por fortes sinais de TCR induzidos por estimulação com anticorpos anti-TCRδ ou anti-CD3ε, mas estes efeitos foram anulados pela inibição farmacológica da via MEK/ERK . Estes dados fornecem evidência direta em apoio à idéia de que a força do sinal γδTCR é um determinante crítico da função efetora da célula γδT.

No nível transcripcional, o forte sinal γδTCR induz a expressão de reguladores transcripcionais associados a γδT1, como Egr2, Egr3 e Id3, resultando em um destino celular γδT1 . Id3 inibe a adoção do destino celular γδT17 ao inibir a regulação transcripcional mediada por HEB (codificada por Tcf12) . HEB pode ligar diretamente a montante dos sites de início transcripcional dos Sox4 e Sox13 para promover sua expressão. Estes fatores transcripcionais associados ao γδT17 são necessários para a expressão do fator transcripcional essencial RORγt (codificado por Rorc) e da proteína de sinalização Blk . Considerando esses fatos, o modelo da força do sinal TCR demonstra claramente os mecanismos pelos quais o sinal TCR controla a função efetora das células γδT.

No entanto, uma série de estudos demonstrou o impacto da ablação genética das moléculas de sinalização TCR na função efetora das células γδT, desafiando a idéia de que só a força do sinal γδTCR determina o destino da diferenciação γδT17/γδT1. Os ratos mutantes Zap70 W163C apresentam uma perda completa do desenvolvimento celular Vγ6+ γδT17 mas têm desenvolvimento normal de células γδT1, enquanto os sinais de TCR são amortecidos nesses ratos. Outro estudo realizado por Silva-Santos e colegas de trabalho mostrou que os ratos são insuficientes para CD3δ e CD3γ (CD3DH), que apresentavam menor expressão da superfície celular dos complexos γδTCR/CD3 e sinalização γδTCR deficiente, mostrou uma redução acentuada do desenvolvimento tímico das células Vγ6+ γδT17 bem como das células γδT1 mas não das células Vγ4+ γδT17, indicando que os subconjuntos γδT17 requerem uma força de sinal distinta γδTCR para o seu desenvolvimento . Embora o desenvolvimento de células αβT e a transdução de sinal αβTCR não tenham sido afetados nos ratos CD3DH, esta linhagem de rato é o único modelo animal até agora em que a inibição específica da sinalização γδTCR foi demonstrada. Ainda não está claro porque as células γδT são especificamente afetadas em camundongos CD3DH, mas é provável que a composição distinta dos complexos TCR-CD3 αβT e γδT seja responsável pelo fenótipo único dos camundongos CD3DH. Neste contexto, deve-se notar que ratos com a mutação CD3ε C80G, que é incapaz de induzir mudanças conformacionais na TCR, também exibem alterações no desenvolvimento celular γδT17, mas o desenvolvimento celular normal γδT1 .

Syk é necessário para a diferenciação γδT17

Recentemente, relatamos um novo mecanismo regulatório pelo qual as kinasesximais de γδTCR Syk e Zap70 controlam diferentemente γδT17 indução . Ratos Syk-deficientes exibem perda completa de células γδT17 (ambos os subconjuntos Vγ4+ e Vγ6+) no timo. Notavelmente, a expressão forçada de Zap70 em células T-progenitoras Syk-deficient não conseguiu restaurar a geração de células γδT17, sugerindo um papel não redundante de Syk na diferenciação γδT17. Como as células Syk- mas não Zap70-deficient γδT apresentam uma redução significativa da fosforilação Akt induzida pela estimulação de γδTCR, é indicado que Syk medeia a ativação induzida por γδTCR da via PI3K-Akt. Ratos com deficiência de PI3K (p110γ-/- p110δ-/-) exibem completa inibição do desenvolvimento celular de γδT17 mas não são afetados em termos de seleção de γδ (upregulação CD5) ou desenvolvimento de γδT1. A inibição do PI3K demonstrou reduzir a expressão dos fatores de transcrição associados ao γδT17 (Rorc, Sox13 e Sox4), sugerindo um papel crucial para o caminho PI3K-Akt na indução do programa de diferenciação do γδT17. Em concordância com isto, um relatório anterior demonstrou que ratos deficientes em kinase-inactive PI3Kδ ou PI3Kγ apresentam uma redução acentuada no número de células periféricas γδT17 e uma melhoria da inflamação γδT17-dependente. O caminho PI3K-Akt também é necessário para a diferenciação das células produtoras de IL-17 αβT (Th17) , sugerindo que este caminho de sinalização é um mecanismo regulador comum compartilhado por αβT e γδT linhagens para induzir subgrupos pró-inflamatórios produtores de IL-17.

γδTCR-induzida ativação do caminho PI3K-Akt depende de Syk mas não de Lat, indicando que Syk dirige o caminho PI3K-Akt para induzir a diferenciação de γδT17 além do caminho de sinalização principal dependente de Lat que induz a seleção de γδ. Não está claro se o Syk ativa o caminho PI3K/Akt em células γδT através da interação direta ou de forma indireta. Um estudo anterior relatou que ratos com deficiência de Rasgrp1 apresentam um efeito ou fenótipo de célula γδT semelhante ao dos ratos com deficiência de PI3K (ou seja, perda de células γδT17 e aumento de células γδT1) . Como Rasgrp1 pode funcionar como um ativador upstream do caminho PI3K/Akt na sinalização αβTCR , é provável que os relés Rasgrp1 sinalizem de γδTCR para PI3K para induzir a diferenciação γδT17.

Perda preferencial de células γδT17 também foi relatada em ratos deficientes para Blk, uma kinase da família Src expressa em células γδT assim como em células B, embora sua função em γδTCR a transdução do sinal seja desconhecida .

Zap70 controla certos subconjuntos de células γδT

Nós também demonstramos o papel de Zap70 na diferenciação tímica de células γδT . Os ratos com deficiência Zap70 apresentam uma redução acentuada de células Vγ6+, a maioria das quais são γδT17 mas não são afectadas em termos do desenvolvimento de outras células γδT, incluindo os subconjuntos Vγ1+ bem como Vγ4+. De facto, o nível de expressão da proteína Zap70 foi mais elevado no subconjunto Vγ6+ entre as células de γδT. Como a expressão CD5 foi menor nas células Vγ6+ deficientes em Zap70 do que nas células de controle, o Zap70 é provavelmente necessário para a maturação tímica das células Vγ6+. Em nossos experimentos, os ratos com deficiência de Zap70 apresentaram diferenciação tímica normal das células Vγ4+, incluindo o subconjunto γδT17, o que contradiz o relatório anterior no qual uma mutação hipomórfica do Zap70 causou uma redução das células tímicas Vγ4+ γδT17 . Esta discrepância pode ser devida aos diferentes ratos utilizados nos dois estudos (o grupo de Hayday utilizou ratos hipomórficos Zap70 mutantes sobre um fundo BALB/c, enquanto nós utilizamos ratos completos com deficiência de Zap70 sobre um fundo C57BL/6). Além disso, os ratos Zap70-deficientes apresentaram uma redução significativa nas células periféricas Vγ4+, que incluíam os subconjuntos γδT17 e γδT1, mas tinham células Vγ1+ não danificadas. Assim, em contraste com seu papel essencial no desenvolvimento celular de αβT, a exigência do Zap70 se limita à maturação tímica das células Vγ6+ e à manutenção periférica das células Vγ4+.

Nossas descobertas sobre os diferentes papéis do Zap70 e Syk podem fornecer uma nova pista para entender os mecanismos de sinalização γδTCR e desenvolvimento celular γδT. Zap70 é necessário para a sinalização de αβTCR e γδTCR em certos subconjuntos de células γδT. Nas células αβT, a ativação do Zap70 depende do Lck, que é acoplado aos coreceptores CD4 ou CD8 que se ligam aos pMHC na superfície das células que apresentam antígenos. Assim, sugere-se que o Lck-Zap70 é um eixo de sinalização especializado no reconhecimento de antígenos obtidos por contato celular; embora no caso das células γδT, ainda não esteja claro como o Zap70 é ativado, apesar da falta de expressão do CD4 e CD8. Em contraste, Syk está associado a uma ampla gama de imunorreceptores, incluindo pré-TCR, γδTCR, BCR, e FcR . Como Syk é capaz de fosforilizar ITAMs e alvos downstream independentemente da família Src kinases como Lck , estes receptores podem ser ativados liga-independentemente ou mediante ligação a uma variedade de antígenos solúveis, bem como antígenos de superfície celular. Assim, a utilização do Syk ou Zap70 na sinalização imunorreceptora pode ditar como o receptor reconhece o antígeno. De fato, a expressão de Syk no lugar de Zap70 tornou as células αβT capazes de responder à estimulação de anticorpos anti-CD3 solúveis, enquanto células normais αβT só responderam a anticorpos anti-CD3 multimerizados que imitam a interação com a superfície celular pMHC . Esses achados nos levaram a supor que o modo de reconhecimento de antígenos usado pelos linfócitos poderia ser determinado não apenas pelo seu receptor per se, mas também pelo uso distinto da família Syk kinases. Com base neste conceito, prevemos que existem células endógenas na superfície celular γδTCR ligandos necessários para a maturação tímica das células Vγ6+, bem como a manutenção periférica das células Vγ4+, e que as células Vγ1+ não necessitam de células na superfície celular γδTCR ligandos para o seu desenvolvimento e/ou manutenção.

γδTCR processos independentes e -dependentes para γδT17 indução

Um relatório recente demonstrou elegantemente que as células γδT17 provêm de um progenitor que é distinto dos outros subconjuntos de células γδT . Foi relatado que progenitores intratímicos de origem fetal que expressam níveis elevados de Sox13 foram identificados em uma população previamente categorizada como DN1d (CD44+CD25-c-kit-CD24hi) timócitos. Estes progenitores de Sox13+ deram origem preferencialmente a γδT17 células no timo fetal reconstituído, enquanto que outros progenitores dentro da população DN2 não o fizeram. Mais importante ainda, os progenitores Sox13+ eram detectáveis e seus programas de linhagem γδT17 estavam intactos em ratos com deficiência de TCRδ ou Rag-deficiente, indicando que o destino da linhagem γδT17 é “prewired” por um mecanismo independente das células, γδTCR. Um relatório anterior, entretanto, mostrou que as células γδT17 podem se desenvolver a partir do estágio DN2 (CD44+CD25+c-kithi) quando co-cultivadas em uma monocamada de células do estroma Notch ligand-expressing. Assim, pode haver a necessidade de redefinir os estágios de diferenciação e as relações progenitor-descendente no desenvolvimento da célula γδT.

Figure 3 resume os processos de diferenciação das células γδT assim como das células αβT, destacando as diferenças na exigência dos sinais αβ/γδTCR e das kinases da família Syk. Os primeiros passos da diferenciação, ou seja, β-seleção para a linhagem de células αβT e γδ-seleção para a linhagem de células γδT, são impulsionados pela sinalização pré-TCR independente de ligação ou γδTCR, que serve como ponto de verificação para as células que expressam uma cadeia funcional TCRβ ou γδTCR cadeia, respectivamente. Estes sinais receptores independentes de ligação são iniciados por Syk, que é expresso em timócitos DN, incluindo os precursores γδT. Na linhagem celular γδT, o sinal Syk-mediated γδTCR também é necessário para o priming de γδT17 diferenciação celular através da ativação da via PI3K. Durante a selecção de β e γδ, a expressão de Syk e Zap70 é regulada de forma inversa: O Syk é desregulado enquanto o Zap70 não é regulado na sinalização pré-TCR ou γδTCR. Portanto, o passo posterior na diferenciação da linhagem αβT depende da sinalização Zap70-mediada αβTCR, que permite que os timócitos DP reconheçam pMHC na superfície dos TEC para serem selecionados positiva ou negativamente de acordo com a força da interação αβTCR-pMHC. Em contraste, a sinalização Zap70-mediada γδTCR em resposta aos ligandos endógenos determina a função efetora das células γδT: um sinal forte induz γδT1, enquanto que um sinal fraco/não induz γδT17.