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MÉTODOS DE TESTE PARA FOTOTOTOXICIDADE E ALTERNATIVOS ANIMAIS
É essencial garantir a foto-segurança dos produtos químicos quando há chances de exposição humana, como pode ser claramente exemplificado por produtos farmacêuticos (20) ou cosméticos (21). Para avaliar o potencial de fototoxicidade de uma substância química, foram introduzidos vários métodos de teste que variam de in silico(22), in quimico(23), in vitro a ensaio in vivo. Em ensaios químicos como a geração ROS (24), testes in vitro que incluem o ensaio 3T3 NRU e modelo de epiderme 3D, e estudos in vivo empregando cobaia, rato ou ratos pigmentados foram desenvolvidos e utilizados rotineiramente (25).
Fonte leve para fototoxicidade. A fonte de luz para fototoxicidade é extremamente importante uma vez que os comprimentos de onda absorvidos pela substância em estudo (espectro de absorção) e a dose de luz (alcançável num tempo de exposição razoável) deve ser suficiente para induzir fototoxicidade (26). Os simuladores solares que simulam a luz solar natural são considerados a fonte de luz artificial ideal (Fig. 5).
A distribuição da potência de irradiação do simulador solar filtrado deve ser próxima da da luz do dia exterior. Os simuladores solares estão equipados com arcos de xenônio ou (dopados) arcos de halogeneto de mercúrio-metal. Eles também devem ser filtrados adequadamente para atenuar os comprimentos de onda UVB altamente citotóxicos. O espectro registado abaixo destes filtros não deve desviar-se da luz do dia exterior normalizada (Especificação: FDA CFR Part 201.327, ISO 24444:2010(e), CIE-85-1989).
Não obstante, outras fontes de luz UVA como a lâmpada UVA também podem ser usadas com um dosímetro UV adequado para verificar a intensidade e o comprimento de onda. A intensidade da luz (irradiância) varia dependendo das fontes, e deve ser verificada regularmente antes de cada teste de fototoxicidade usando um medidor de UV de banda larga adequado. O medidor de UV deve ter sido calibrado antes de cada medição. Assim, o tempo de irradiação depende da intensidade da fonte de luz (por exemplo, para uma fonte de luz de 1,7 mW/cm2, é necessário um tempo de exposição de 50 minutos para atingir 5 J/cm2). O tempo de irradiação também varia de acordo com os métodos de teste. Uma dose de 5 J/cm2 (medida na faixa UVA) foi determinada como não citotóxica, mas suficientemente potente para excitar produtos químicos para provocar reações fototóxicas no ensaio de absorção de vermelho neutro 3T3.
3T3 Ensaio de absorção de vermelho neutro. O ensaio 3T3 NRU foi oficialmente aprovado pela OCDE e endossado como OECD TG432 em 13 de Abril de 2004 (3). Este teste avalia a fotocitotoxicidade determinando a redução relativa da viabilidade celular após a exposição ao produto em estudo na presença versus ausência de irradiação UV/VIS. A decisão de realizar o teste de fototoxicidade 3T3 NRU está sendo feita para as substâncias químicas que mostram espectros de absorção na região UV/VIS quando dissolvidas em solvente apropriado (17). Tem sido sugerido que se o coeficiente de extinção/absorção molar for inferior a 10 litros x mol-1 x cm-1, é improvável que a substância química seja fotoreativa (por exemplo, em cubeta UV com percurso de luz de 1 cm de comprimento, DO de solução 0,05 M deve ser inferior a 0,5 para ser considerada como não fotoreativa com base na equação “absorvância = coeficiente de extinção x comprimento do percurso x concentração”) (26). O teste 3T3 NRU apresenta uma capacidade preditiva específica altamente sensível mas baixa (uma sensibilidade de 93% e uma especificidade de 84%). O teste 3T3 NRU tem muitas limitações. Ele não pode prever efeitos adversos além da foto(cito)toxicidade que podem surgir da ação combinada de uma substância química e da luz, como fotogenotoxicidade, fotoalergia(fotossensibilização) ou fotocarcinogenicidade. O teste 3T3 NRU está sendo empregado apenas para identificação de perigos enquanto sua utilidade para a avaliação da potência fototóxica não é justificada. Em particular, este sistema de ensaio carece de atividade metabólica que é crítica na manifestação de produtos químicos expostos sistemicamente. Portanto, para produtos químicos expostos sistemicamente que requerem ativação metabólica como monocrotalina, riddelliina e heliotrina (alcalóides pirrolizidina) (28), são recomendados estudos in vivo em animais (5,29).
Fundamental test principle of 3T3 NRU is the comparison of cell viability in the presence or absence of UV/Vis irradiation as determined with vital dye, neutral red, which is a weak cationic dye that prontamente penetrates cell membranes and accumulating intracellularly in lysosomes of viable cells. A linha celular base é a célula Balb/c 3T3, que é um fibroblasto de camundongo desenvolvido a partir de embriões de camundongo por G.T. Todaro em 1968. A designação 3T3 significa “transferência de 3 dias, inóculo 3 × 105 células” em prato de 20 cm2, e esta célula é relativamente estável, prontamente disponível e fácil de manusear (30). O fibroblasto dérmico é uma das células alvo de fototoxicidade fornecendo uma sólida fundamentação para o emprego de células 3T3.
Para decidir se o produto em estudo é fototóxico ou não no ensaio 3T3 NRU, a concentração-resposta deve ser obtida na presença e na ausência de irradiação. O Fator de Foto-Irritação (PIF) ou Efeito Foto-Médio (EMA) deve ser calculado (31). PIF é a razão de IC50 (concentração que diminui a viabilidade celular em 50%) de não irradiado sobre irradiado como mostrado na Fig. 7.
Quando IC50 não pode ser obtido, o MPE é calculado como a seguinte equação
PIF < 2 ou um MPE < 0.1 prediz: “sem fototoxicidade”. Um PIF > 2 e < 5 ou um MPE > 0.1 e < 0.15 prediz: “provável fototoxicidade” e um PIF > 5 ou um MPE > 0.15 prevê: “fototoxicidade” (Fig. 8).
Erythrocyte hemolysis test. As membranas celulares são vulneráveis a ROS e radicais gerados por fotoquímica. Danos induzidos por UVA de eritrócitos e hemólise resultante (fotohemólise) são capitalizados para avaliar o potencial fototóxico dos artigos em estudo (32). Os glóbulos vermelhos de ovelha (CEP) são incubados com produtos químicos e irradiados com UVA a 20 J/cm2. Após a irradiação, as hemácias foram incubadas no escuro por 2 horas à temperatura ambiente e depois por mais 1 hora em 37℃, após o que a hemólise foi medida com o reagente de Drabkin e a absorção de UV a 540 nm. A extensão da fototoxicidade foi avaliada pela liberação de hemoglobina do SRBC, ou seja, atividade fotohemolítica seguindo a equação (33).
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ADE: densidade óptica da solução de droga exposta com eritrócitos
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AD: densidade óptica da solução de droga exposta sem eritrócitos
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C: densidade óptica da solução de controle 100% hemolítico
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Fototoxicantes como ciprofloxacina, norfloxacina ou enoxacina aumentam significativamente a atividade fotohemolítica além de 20% a 100 μg/mL. A sensibilidade, especificidade e precisão deste teste foram de 67%, 73% e 73%, respectivamente para 24 produtos químicos (8 fragrâncias, 5 absorvedores de UV, 4 drogas, 4 antimicrobianos e 3 corantes) em comparação com o teste in vivo para cobaias (34). A baixa sensibilidade pode ser problemática e seu desempenho é muito inferior ao do teste 3T3 NRU, o que pode explicar o uso reduzido deste teste recentemente.
Modelo de epiderme 3D humana in vitro. Para superar as limitações dos métodos baseados em células in vitro, o modelo de epiderme reconstruída em 3D está sendo investigado para aplicação em testes de fototoxicidade (35,36). Basicamente o princípio do teste é semelhante ao teste 3T3 NRU, ou seja, a avaliação da diferença de viabilidade tecidual entre a presença e a ausência de irradiação UV/VIS. Pode ser utilizado um modelo de predição semelhante empregando PIF e MPE (37). No modelo 3D de epiderme, entretanto, materiais insolúveis em água podem ser testados e uma certa capacidade metabólica é preservada nos queratinócitos primários da camada epidérmica que podem ser aplicados aos tóxicos que requerem ativação metabólica (38). Além disso, é possível medir a produção de citocinas como IL-1β (Interleucina-1β) (39), ensaio de cometa (40) e exame histológico que podem ser considerados na avaliação posterior da fotoalergenicidade e fotocarcinogenecidade.
Métodos in vivo empregando cobaias, ratos ou ratos pigmentados. Animais de laboratório, como ratos e cobaias, estão sendo empregados para simular cenários reais de fototoxicidade humana. Os animais são expostos a produtos químicos topicamente ou sistemicamente e irradiados com dose apropriada de UVA (geralmente 10 J/cm2 para o teste das cobaias, 20 J/cm2 para o teste do rato (41)). A pontuação de eritema e edema de 0 a 4 é somada e a pontuação máxima durante 72 horas de observação é calculada como média por animal para gerar índice de irritação. O índice de fototoxicidade está sendo obtido pela equação “Índice de irritação de UVA-irradiado – Índice de irritação de local não-irradiado” (42). Índice de fototoxicidade acima de 0,6 indica o potencial de fototoxicidade. Alternativamente, a espessura da orelha pode ser medida para estimar o edema em testes com o mouse. Estes testes in vivo refletem bem o processo fisiopatológico de fototoxicidade em humanos, mas sacrifícios de animais, despesas e tempo necessário para conduzir o teste coloca muitos problemas, especialmente na era da ampla conscientização do bem-estar animal e da ética. Testes de fototoxicidade não baseados em animais estão ganhando popularidade hoje em dia para superar esses problemas (43).
Em métodos químicos para avaliação de fototoxicidade. Métodos de tubos de ensaio sem células, nomeadamente em quimico têm sido explorados para avaliar a fototoxicidade. Informações sobre a absorção de luz e fotoestabilidade do produto em estudo foram analisadas para prever a fototoxicidade (44). Empregando a geração de espécies reativas de oxigênio durante a fotoexcitação e posterior fotorreação, o potencial fototóxico de uma substância química pode ser avaliado em quimico(12). O oxigênio singlet é detectado pelo clareamento com p-nitrosodimetilanilina (RNO) enquanto o teste Nitro Blue-Tetrazolium (reação NBT-formazan) é empregado para determinar a geração de peróxidos, como descrito abaixo (24),
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Oxigénio singelo + imidazol
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→ → imidazol oxidado
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+ RNO
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→ branqueamento RNO + produtos
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ensaio de geração ROS exibiu a sensibilidade e especificidade de 90% e 76.9% para cosméticos e 100% e 75% para produtos químicos não-cosméticos. A atividade de quebra de fios de DNA é outra forma de avaliar a fototoxicidade induzida por UV de diferentes tipos de produtos químicos, ou drogas em quimico através da quantificação do DNA circular aberto ou fechado. Este ensaio também não requer células ou tecidos vivos, mas sim plasmídeo. O plasmídeo é dissolvido em tampão e misturado com os artigos em estudo. Após a mistura ter sido irradiada com UV, as amostras são submetidas a electroforese. A quantidade de DNA quebrado é analisada por tecnologia baseada em fluorescência. O composto fototóxico induzido por UV resulta na abertura de cordões de ADN e depende da concentração da droga e da dose de irradiação UV (33). Estes testes não requerem células vivas ou tecidos que possam aumentar a variabilidade dos resultados dos testes. No entanto, estes métodos têm limitações que incluem a falta de capacidade de activação metabólica, inaplicabilidade de materiais insolúveis em água (óleos, sólidos, géis, produtos formulados), e incapacidade de prever a fotogenotoxicidade, fotoalergia (fotossensibilização) ou fotocarcinogenicidade. Este teste é limitado à identificação de perigos, não para uma avaliação da potência fototóxica.