Utilizar NEBcutter

NEBcutter aceita uma sequência de entrada, que pode ser colada, retirada de um ficheiro local ou recuperada do NCBI como um ficheiro GenBank através do seu número de acesso. Várias opções estão disponíveis para seleccionar o tamanho dos ORFs a serem exibidos e o conjunto de enzimas de restrição a serem usadas. O programa calcula as posições de todos os sites de enzimas de restrição observando aquelas que podem ser potencialmente bloqueadas pela metilação sobreposta e encontra as ORFs na sequência. Em seguida, exibe um diagrama esquemático da seqüência, os ORFs longos, com base nas regras descritas nos Métodos e em todas as enzimas de restrição que a cortam apenas uma vez. A exibição inicial também mostra as enzimas que podem ser usadas em um digestor completo para a digestão de cada ORF que é exibido. A Figura11 mostra um digestor típico, neste caso uma visão linear do plasmídeo pBR322. Se a seqüência original de DNA for circular, então ambos os displays lineares e circulares são oferecidos. A partir do visor inicial, há muitas opções para ir além, incluindo digestão personalizada com enzimas de sua escolha e vários visores do digerido. Também é possível, a partir de visores lineares, fazer zoom em uma região selecionada da seqüência para uma visualização mais detalhada. Uma opção permite selecionar uma determinada região e exibir as enzimas que cortam imediatamente adjacentes à região. Isto é útil para encontrar enzimas capazes de aplicar o imposto de consumo na região desejada. Se o zoom leva a uma região de <60 nucleotídeos então a seqüência real é exibida (Fig. (Fig.2),2), juntamente com qualquer tradução que seja apropriada. Neste display todas as enzimas que cortam a seqüência são mostradas, todas as bases que formam partes de uma seqüência de reconhecimento de enzimas de restrição são destacadas e movendo o mouse sobre um nome de enzima produzirá uma caixa com a seqüência de reconhecimento anotada e a própria seqüência torna-se sublinhada no display.

Em qualquer exibição principal, movendo o mouse sobre o nome de uma enzima de restrição irá mostrar sua seqüência de reconhecimento e o número exato da base na qual ela se clivará. Se mais de um site estiver presente para a enzima, então todos os outros sites estão sublinhados. Clicando no nome da enzima irá produzir uma página com um resumo de informações sobre a enzima incluindo sua sensibilidade à metilação, os tipos de pontas produzidas, isosquizômeros que estão disponíveis e uma lista de outras enzimas que podem produzir pontas compatíveis. Para as enzimas NEB, são fornecidas informações sobre as condições de digestão e um link para o site da NEB.

Uma característica chave do NEBcutter é que ele incorpora tudo o que é registrado em REBASE sobre a sensibilidade à metilação de qualquer uma das enzimas exibidas quando elas se sobrepõem a um site de barragem (GATC), um site de Dcm (CCWGG), um site de CpG, um site de EcoKI (AACN6GTGC) ou um site de EcoBI (TGAN8TGCT). Quando digestores teóricos são realizados, os resultados incluem uma comparação dos efeitos da metilação destacando as bandas que se deslocam (Fig. (Fig.33).

Em cada página são fornecidos links quentes que levam de volta à página principal, fornecem ajuda na interpretação da exibição ou permitem que os usuários enviem comentários de volta aos autores. A interface foi concebida para ser o mais intuitiva possível e para proporcionar um acesso fácil às principais funções úteis aos investigadores que tentam clivar o seu ADN. A versão actual do NEBcutter já processou mais de 400 000 sequências de utilizadores. Estamos actualmente a preparar uma série de melhorias ao NEBcutter e a versão 2.0 está agendada para lançamento até 1 de Julho.