O dogma central em biologia molecular é DNA→RNA→Protein. Para sintetizar um DNA protéico particular deve primeiro ser transcrito em RNA mensageiro (mRNA). O mRNA pode então ser traduzido no ribossomo em cadeias de polipeptídeos que compõem a estrutura primária das proteínas. A maioria das proteínas é então modificada através de uma série de modificações pós-tradução, incluindo dobramento de proteínas, formação de pontes de dissulfeto, glicosilação e acetilação para criar proteínas funcionais e estáveis. A expressão proteica refere-se ao segundo passo deste processo: a síntese de proteínas do mRNA e a adição de modificações pós-tradução

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Pesquisadores usam várias técnicas para controlar a expressão proteica para aplicações experimentais, biotecnológicas e médicas. As pesquisas podem visualizar proteínas in vivo, marcando-as com proteínas fluorescentes para estudar a localização ou purificar proteínas para estudar sua estrutura, interações e funções. As proteínas também podem ser purificadas para uso em pesquisas de biologia molecular (por exemplo, polimerases e outras enzimas podem ser purificadas e usadas para manipular o DNA), ou na medicina (por exemplo, insulina).

Proteínas, ao contrário do DNA que pode ser relativamente fácil de sintetizar, devem ser produzidas usando misturas complexas derivadas de células ou usando células vivas. Existem vários tipos de sistemas de expressão utilizados para a produção e purificação de proteínas. Estes incluem mamíferos, insetos, bactérias, plantas, leveduras e sistemas de expressão livre de células.

A estratégia geral para expressão de proteínas consiste em transfectar células com seu modelo de DNA de escolha e permitir que estas células transcrevam, traduzam e modifiquem suas proteínas de interesse. As proteínas modificadas podem então ser extraídas de células lisadas através do uso de tags de proteínas e separadas de contaminantes usando uma variedade de métodos de purificação. A escolha do sistema de expressão a utilizar depende de vários factores:

1. A proteína que você está tentando expressar
2. Quanta proteína você precisa
3. Os seus planos para aplicações downstream

Neste post de blog vamos resumir alguns dos sistemas de expressão mais comuns, incluindo suas vantagens e ressalvas a ter em mente antes de escolher um sistema.

Sistemas de expressão de mamíferos

Células de mamíferos são um sistema ideal para a expressão de proteínas de mamíferos que requerem múltiplas modificações pós-tradução para uma função protéica adequada. A maioria das construções de DNA projetadas para expressão de mamíferos utiliza promotores virais (SV40, CMV e RSV) para expressão pós-transfecção robusta. Os sistemas de mamíferos podem expressar proteínas de forma transitória ou através de linhas celulares estáveis. Ambos os métodos produzem altos rendimentos protéicos se a transfecção for bem sucedida.

alguns sistemas de mamíferos também permitem controlar quando uma proteína é expressa através do uso de promotores constituintes e induzíveis. Os promotores induzíveis são extremamente úteis se um produto protéico desejado for tóxico para as células em altas concentrações. Apesar das suas vantagens, os sistemas de expressão de mamíferos requerem condições de cultura celular exigentes em comparação com outros sistemas.

Sistemas de expressão de insetos

Células de insetos também podem ser usadas para produzir proteínas eucarióticas complexas com as modificações pós-tradução corretas. Existem dois tipos de sistemas de expressão de insetos; células infectadas por baculovírus e células nãolíticas de insetos.

Os sistemas de expressão de baculovírus são muito poderosos para expressão de proteínas recombinantes de alto nível. Estes sistemas permitem uma alta expressão de proteínas muito complexas, glicosiladas, que não podem ser produzidas em E. coli ou células de levedura. O único problema com os sistemas de baculovírus é que a célula hospedeira infectada é eventualmente lisada. A lise celular interrompe a produção de proteínas, mas existem sistemas de expressão de células nãolíticas de insetos (sf9, Sf21, células Hi-5) que permitem a expressão contínua de genes integrados no genoma da célula do inseto. Ambos os tipos de sistemas de expressão de insectos podem ser escalados para a produção de grandes quantidades de proteínas.

Alguns inconvenientes dos sistemas de expressão de células de insetos incluem que a produção de vírus pode ser bastante demorada e que as células de insetos requerem condições de cultura similares aos sistemas de expressão de mamíferos.

Sistemas de expressão de bactérias

Quando se quer produzir grandes quantidades de proteína de forma rápida e barata, uma célula hospedeira bacteriana é quase sempre a resposta. E. coli é definitivamente um dos mais populares hospedeiros para expressão de proteínas com várias estirpes especializadas para expressão de proteínas. A expressão de proteínas em bactérias é bastante simples; a codificação do DNA para a sua proteína de interesse é inserida em um vetor de expressão plasmídeo que é então transformado em uma célula bacteriana. As células transformadas propagam-se, são induzidas a produzir a sua proteína de interesse, e depois lisadas. A proteína pode então ser purificada dos resíduos celulares.

Existem vários vectores de DNA populares que podem ser usados para produzir grandes quantidades de proteína em células bacterianas: o pET, pRSET, Gateway pDEST, e vectores pBAD, por exemplo. A expressão da proteína de cada um desses vetores é controlada por um promotor diferente, resultando em diferentes níveis de expressão de cada vetor; uma expressão inferior pode ser necessária se a sua proteína for tóxica para E. coli. De todos os vetores, o pET, sob o controle do promotor T7 lac e induzido pela lactose, fornece o maior nível de expressão da proteína.

Apesar da sua facilidade de utilização, é importante notar que as bactérias normalmente não conseguem produzir proteínas de mamíferos multi-domínio funcionais, uma vez que as células bacterianas não estão equipadas para adicionar modificações pós-tradução apropriadas. Além disso, muitas proteínas produzidas por bactérias tornam-se insolúveis, formando corpos de inclusão que são difíceis de extrair sem reagentes duros e paciência.

Sistemas de expressão de plantas

Plantas fornecem um meio barato e de baixa tecnologia de expressão em massa de proteínas recombinantes. Muitas células de vários tipos de plantas como milho, tabaco, arroz, cana-de-açúcar e até mesmo tubérculos de batata têm sido utilizados para a expressão de proteínas.

Sistemas de plantas compartilham muitas das mesmas características e requisitos de processamento que os sistemas de expressão de células de mamíferos, incluindo a maioria das complexas modificações pós-tradução. A extracção e purificação das proteínas recombinantes das plantas pode, no entanto, ser cara e demorada, uma vez que os próprios tecidos das plantas são bioquimicamente complexos.

Para contornar estas questões, os cientistas têm aproveitado a secreção natural de bioquímicos e proteínas através das raízes das plantas. A marcação de proteínas recombinantes com um peptídeo vegetal naturalmente secretado permite um acesso mais fácil e a purificação de uma proteína desejada. Apesar de ser uma tecnologia bastante nascente, as células vegetais têm sido usadas para expressar uma ampla gama de proteínas, incluindo anticorpos e produtos farmacêuticos, especificamente interleucinas.

Sistemas de expressão de leveduras

As leveduras são um grande sistema de expressão para gerar grandes quantidades de proteínas eucarióticas recombinantes. Embora muitas espécies de leveduras possam ser usadas para expressão de proteínas, S. cerevisiae, é a espécie mais confiável e freqüentemente usada devido ao seu uso como organismo modelo em genética e bioquímica.

Ao usar S. cerevisiae, os pesquisadores frequentemente colocam proteínas recombinantes sob o controle do promotor de galactose induzível (GAL). Outros promotores comumente usados incluem os promotores fosfato e cobre induzível PHO5 e CUP1, respectivamente. As células de levedura são cultivadas em meios bem definidos e podem ser facilmente adaptadas à fermentação, permitindo uma produção estável e em larga escala de proteínas.

Em geral os sistemas de expressão de levedura são mais fáceis e baratos de trabalhar do que as células de mamíferos, e são muitas vezes capazes de modificar proteínas complexas ao contrário dos sistemas bacterianos. As células de levedura, no entanto, têm uma taxa de crescimento mais lenta do que as células bacterianas e as condições de crescimento precisam muitas vezes de ser optimizadas. As células de levedura também são conhecidas por proteínas hiperglicosilantes que podem ser um problema dependendo da proteína de sua escolha.

Sistemas de expressão livre de células

Em sistemas de expressão livre de células, as proteínas são montadas in vitro usando componentes purificados da maquinaria de transcrição e tradução. Estes incluem ribossomos, RNA polimerase, tRNAs, ribonucleotídeos e aminoácidos. Os sistemas de expressão sem células são ideais para a montagem rápida de mais de uma proteína em uma reação. Uma grande vantagem destes sistemas é a sua capacidade de montar proteínas com aminoácidos rotulados ou modificados que são úteis em diferentes aplicações a jusante. Os sistemas de expressão sem células, no entanto, são caros e tecnicamente muito difíceis de usar.

Alyssa D. Cecchetelli é um cientista da Addgene. Ela recebeu seu PhD da Northeastern University e está particularmente interessada em sinalização e comunicação celular. Ela adora ser capaz de ajudar a comunidade científica a compartilhar plasmídeos.

Recursos adicionais

• Sistemas de expressão de proteínas Thermofisher
• Expressão de proteínas recombinantes em Escherichia coli: avanços e desafios
• Produção de proteínas recombinantes em exsudados de raízes de plantas