“Uma técnica genética molecular utilizada para a manipulação, alteração ou modificação direta de genes ou genoma de organismos a fim de manipular os fenótipos é chamada engenharia genética”.

Or em outras palavras, podemos dizer,

“A engenharia genética é uma técnica usando a qual a composição genética de um organismo pode ser alterada”.

A técnica é muitas vezes conhecida como manipulação genética, modificação genética ou alterações genéticas, geralmente é categorizada como engenharia genética.

Nesta técnica, um DNA recombinante é construído e inserido no genoma hospedeiro usando um vector. Ou podemos apagar algumas sequências mutantes de um genoma. O primeiro ADN recombinante foi construído por Paul Berg em 1972.

Usando a técnica de engenharia genética, organismos geneticamente modificados podem ser construídos que são economicamente muito importantes para nós.

É empregado para a produção de espécies vegetais melhoradas, drogas terapêuticas ou proteínas, prevenção de doenças genéticas hereditárias e construção de um organismo geneticamente modificado.

No presente artigo, vamos falar principalmente de engenharia genética e suas aplicações. O conteúdo do artigo é,

• O que é engenharia genética
  • Definição
  • História
  • Tipos
  • Processo
• Aplicação da engenharia genética
• Limitações da engenharia genética
• Conclusão

Humans estão manipulando o material genético de muitos organismos por muito tempo. Usando a reprodução seletiva e a hibridação cruzada, espécies vegetais economicamente importantes foram criadas por nós.

O objetivo de desenvolver a engenharia genética ou técnica de manipulação genética é produzir organismos ou fenótipos que são úteis para nós. Técnicas de engenharia genética são usadas para,

• Construção de espécies de plantas geneticamente modificadas.
• Espécies vegetais bióticas e bióticas resistentes ao stress.
• Economicamente importantes espécies de plantas
• Organismo de valor comercial
• Para a produção de drogas terapêuticas
• Prevenção de anomalias genéticas.

“Na engenharia genética, o DNA de duas células diferentes são combinadas e inseridas no genoma hospedeiro via vector”. Componentes importantes das experiências de manipulação genética são explicados aqui.

Gene de interesse: Uma sequência de ADN que queremos inserir nas nossas células alvo.

Vetor: usando o DNA plasmídeo como vetores, o gene de interesse é inserido no genoma hospedeiro. Vetores são tipos de veículos que transferem o material genético.

Células-alvo: as células-alvo são a população de células cujo genoma queremos manipular ou mudar.

Definições:

“Uma técnica usada para inserir ou apagar um gene mutante ou para manipular um genoma de um organismo é conhecida como engenharia genética.”

História da engenharia genética:

O termo engenharia genética foi usado pela primeira vez pelo romancista de ficção científica, não por nenhum cientista. No ano de 1951, Jack Williamson usou o termo “engenharia genética” pela primeira vez em seu romance “Ilha do Dragão”.

Logo depois, a estrutura molecular do DNA foi descoberta por Watson e Crick, embora as experiências genéticas fossem populares desde a época de Mendel.

O primeiro DNA recombinante foi construído por Paul Berg em 1972. No mesmo ano, Herbert Boyer e Stanley Cohen realizaram experiências de transferência genética. Em 1974, Rudolf Jaenisch tinha criado ratos geneticamente modificados, a primeira vez na história da genética.

Após o sucesso de Rudolf, a espécie de planta de tabaco geneticamente modificada ou geneticamente modificada foi desenvolvida em 1976.

Durante este período (entre 1960 a 1990) foram descobertas técnicas de digestão restrita, ligadura e técnicas semelhantes à PCR que deram asas à tecnologia da engenharia genética.

Artigo relacionado: O que é um genoma?

Tipo de técnicas de engenharia genética:

DNA recombinante – Uma tecnologia de DNA recombinante é um tipo de tecnologia de engenharia genética em que uma molécula de DNA artificial é construída ligando dois DNAs diferentes usando métodos físicos. Para isso, o gene de interesse é inserido no vector plasmídeo e utilizado para experiências de transferência genética.

Entrega de genes – Técnica de entrega de genes é empregada para a inserção de um gene de interesse no genoma hospedeiro.

Electrophoration, solicitation and viral vector-mediated gene transfer, liposome-mediated gene transfer, transposon-mediated gene transfer são alguns dos métodos usados para isso.

Edição do gene – Uma técnica de edição de genes é usada para editar o genoma no qual uma sequência indesejada de DNA é removida ou um novo gene pode ser inserido no genoma hospedeiro. CRISPR-CAS9, TALEN e ZFN são algumas ferramentas conhecidas de edição de genes usadas em experimentos de terapia gênica.

Ler mais: O que é edição de genes e CRISPR-CAS9?

Processo de engenharia genética:

A técnica da engenharia genética é usada para muitos propósitos diferentes, portanto temos de decidir primeiro o propósito da experiência. Todo o processo da engenharia genética pode ser dividido em 5 etapas mais amplas:

• Selecção e isolamento do gene candidato
• Selecção e construção do plasmídeo
• Transformação do gene
• Inserção do DNA no genoma hospedeiro
• Confirmação da inserção

Selecção e isolamento do gene candidato:

O gene deve conter uma sequência de ADN que queremos estudar e para isso, um gene tem algumas características especiais. Um gene candidato deve ter um alto conteúdo de GC e uma seqüência de DNA repetitivo inferior.

Além disso, o gene de interesse não deve ser muito longo, apenas alguns genes kb podem ser inseridos com sucesso. Quanto mais longo for o gene maior será a chance de falha. O gene candidato deve ter um códon inicial e um códon de parada nele. Artigo relacionado: O que é o Código Genético?

Agora, o gene de interesse pode ser isolado do resto do DNA usando a digestão de restrição ou a reação em cadeia da polimerase.

As endonucleases de restrição são as enzimas bacterianas que têm o poder de digerir a sequência de DNA em um local específico. Usando um tipo específico de endonucleases de restrição, podemos cortar e isolar o nosso gene de interesse.

O método de digestão de restrição é explicado no nosso artigo anterior: O que é a digestão de restrição?

Na reacção em cadeia da polimerase, usando a informação da sequência genética, o gene de interesse ou o gene candidato é amplificado no termociclador.

A máquina, usando a reacção em cadeia da polimerase faz milhões de cópias de um gene do nosso interesse. Através do processo de electroforese em gel de agarose, o gene amplificado é isolado.

Se o gene de interesse for bem estudado, previamente, então a informação de um gene é acessível na biblioteca genética e podemos usá-la para a síntese artificial de um gene de nosso interesse. (usando a informação da biblioteca genética, o gene também pode ser sintetizado artificialmente)

No próximo passo, realizar a purificação do DNA, se necessário. Agora nosso DNA está pronto para ser inserido em um plasmídeo.

Seleção e construção do plasmídeo:

Selecionar plasmídeo para a experiência de engenharia genética é um dos passos cruciais em toda a experiência. Antes de selecionar o plasmídeo, devemos entender porque o plasmídeo é usado nos experimentos de transferência genética.

O DNA plasmídeo é um DNA citoplasmático circular, de dupla cadeia, das bactérias que se replicam independentemente.

Os cientistas estão usando-o como um veículo para transferir o gene de interesse para o local alvo no genoma. Ele pode transferir o gene de forma eficiente no local alvo. A estrutura do plasmídeo é explicada na figura abaixo,

Artigo relacionado: O que é um plasmídeo?

Preparação de plasmídeo:

Selecione o plasmídeo que se adequa à sua experiência.

O plasmídeo deve ter a origem da replicação, região promotora, gene de resistência a antibióticos e outras sequências importantes. Usando o método de digestão de restrição, um local de inserção é introduzido no plasmídeo no qual o nosso gene de interesse é ligado.

Utilizando a ligase do DNA T4 como selador de energia, o DNA do nosso interesse em ser inserido e ligado no plasmídeo. Juntamente com o plasmídeo, um marcador selecionável também é introduzido no DNA plasmídeo para identificar o DNA recombinante.

Além disso, uma região promotora e seqüências terminadoras também são incluídas no plasmídeo para a expressão efetiva de um gene de nosso interesse. Um plasmídeo com o nosso gene de interesse e algumas outras sequências importantes é agora referido como uma molécula de ADN recombinante.

Agora nosso DNA recombinante está pronto para a expressão.

Se estamos realizando a clonagem do gene do que o plasmídeo é inserido no hospedeiro bacteriano, para isso geralmente E.Coli é comumente usado. Uma vez que a bactéria começa a se dividir, nosso DNA plasmídeo recombinante também é replicado junto com ela.

Agora temos as múltiplas cópias do nosso ADN plasmídeo que são extraídas usando o kit de extracção de ADN plasmídeo e usadas para as experiências de transformação.

Transformação no genoma hospedeiro:

Transportar o DNA recombinante para a célula receptora ou para o genoma hospedeiro é outra tarefa tediosa e difícil. Vários métodos para inserção de DNA recombinante são usados para vários tipos de células porque um único método não pode ser usado para todos os tipos de células.

Vários métodos para transformação:

Usando stress – as bactérias absorvem facilmente o ADN plasmídeo usando alguns factores de stress, como o calor ou a meia eléctrica.

Microinjeção – uma agulha afiada é usada para inserção de DNA diretamente no núcleo de uma célula, entretanto, o método é menos eficaz e requer um nível mais alto de conhecimento para isso.

Electroporação – um dos melhores métodos com uma grande taxa de sucesso é o método de electroforação em que o ADN recombinante é inserido no genoma hospedeiro através da permeabilização da célula com corrente eléctrica.

Cobrimos um artigo inteiro sobre o mesmo. Leia-o aqui: Electroporation- A Modern Gene Transfer Technique.

Sonication- sonication é mais um bom método às vezes usado na experiência de transferência de genes em que o ADN recombinante é inserido na célula alvo usando ondas ultra-sónicas. As ondas ultra-sônicas também aumentam a permeabilidade das células.

Transferência de genes mediada por lipossoma – Usando uma camada externa semelhante a uma célula artificial conhecida como um DNA recombinante de lipossoma – pode ser inserido no genoma hospedeiro.

Transferência de genes usando infecção bacteriana- Este método é um dos métodos populares e usados rotineiramente em experiências de engenharia genética de plantas. Aqui, a espécie vegetal é infectada pelas bactérias transformadas para a inserção de um gene de interesse.

Agrobacterium tumifecian é utilizado para inserir ADN recombinante na célula vegetal. Um gene de interesse é inserido no Ti- plasmídeo do Agrobacterium. As células vegetais são infectadas por esta cultura de células bacterianas e as células transformadas são regeneradas usando os métodos de cultura de tecidos vegetais.

Químico na transferência de genes – Alguns íons metálicos, químicos e soluções de diferentes químicos também são empregados nas experiências de transferência de genes, no entanto, a taxa de sucesso é muito baixa em comparação com os outros métodos.

Confirmação de inserção:

O nosso trabalho ainda não está concluído.

Agora temos de nos conformar, quer o ADN recombinante seja inserido na nossa célula alvo ou não. Várias tecnologias genéticas moleculares são usadas para isso. No método de cultivo tradicional, a presença ou ausência de um marcador selecionável é usada para diferenciar as células transformadas das células não transformadas.

Embora não seja necessário para o método de detecção baseado em PCR. O método de detecção baseado na reação em cadeia da polimerase é amplamente aceito mais confiável que outros métodos.

DNA é extraído da célula transformada e amplificado usando os primers complementares ao nosso gene de interesse ou ao nosso DNA recombinante.

Se o ADN recombinante estiver presente, certamente amplificou, caso contrário, nenhuma amplificação obtida. Para a conformação dos dois factores, são tomados um conjunto de iniciadores complementares ao ADN recombinante específico e um conjunto de iniciadores complementares à sequência de marcadores seleccionáveis e é realizada a PCR multiplex.

Para validar os resultados, a amplificação deve ser obtida em ambas as reacções.

Mas espere um minuto!

O que aconteceu se alguma mutação ocorreu durante o experimento em nosso gene de interesse? Porque a PCR só pode amplificar o ADN. Devemos precisar de informação de sequência para detectar a mutação.

Para isso, é usado o método de sequenciamento de ADN.

O ADN é extraído das células transformadas e o gene de interesse é amplificado usando a PCR. Agora os amplicons PCR são usados para seqüenciamento de DNA no qual, usando a química fluorescente, a seqüência do nosso gene de interesse é determinada ordeiramente.

Após todos os parâmetros para determinar o gene de interesse preenchidos, as nossas células estão agora prontas para injectar no organismo hospedeiro ou para experiências de cultura de tecidos.

Aplicações da engenharia genética:

Agora chegando ao ponto importante deste tópico, “Para que é usada a engenharia genética?”

A engenharia genética tem grande valor industrial e agrícola. É praticada em medicina, pesquisa genética, agricultura, melhoramento de culturas, e para a produção de drogas terapêuticas.

É também utilizada no desenvolvimento de organismos geneticamente modificados. Aqui estamos discutindo algumas das importantes aplicações da engenharia genética.

A tecnologia do DNA recombinante é usada no melhoramento de culturas e no desenvolvimento de novos traços economicamente importantes. Algumas delas são:

• Resistência a herbicidas
• Resistência a vírus
• Atraso no amadurecimento dos frutos
• Alterado teor de óleo
• Controle de pólen
• Desenvolvimento de espécies de plantas tolerantes ao frio e à seca.

Um exemplo clássico é o algodão BT – um dos tipos de espécies geneticamente modificadas fornece resistência à planta contra bacillus thuringiensis.

Processo de desenvolvimento de espécies de plantas geneticamente modificadas:

Um gene de interesse é isolado do organismo usando digestão de restrição ou amplificado pela reação em cadeia da polimerase. O DNA recombinante é construído pela inserção de um gene de interesse no plasmídeo, aqui é usado o T- plasmídeo.

No passo seguinte, o T- plasmid é inserido no agrobacterium. No último passo, a espécie vegetal é infectada com as células bacterianas transformadas e cultivada. Todo o processo é mostrado na figura abaixo,

GMF- genetically modified food is another best application of genetic engineering in which economically important food products are constructed using recombinant DNA technology.

O exemplo clássico é o tomate Flavr Savr, uma espécie de tomate geneticamente modificado, constituído pela tecnologia do RNA antisense. Tem grandes valores económicos, visto que o tomate GM pode ser facilmente transportado de um lugar para outro.

Outra aplicação importante da engenharia genética é o tomate geneticamente modificado ou o alimento geneticamente modificado.

A qualidade de alguns dos produtos alimentares como o algodão, milho e soja é melhorada utilizando a actual tecnologia do ADN recombinante. O objectivo de desenvolver culturas geneticamente modificadas ou espécies vegetais é torná-las economicamente importantes, nutritivas, ricas em proteínas, resistentes a doenças e ao stress.

Even, usando engenharia genética e técnicas de cultura de tecidos são desenvolvidas espécies vegetais resistentes a inseticidas em tabaco, batata, milho, e algodão.

Além disso, algumas plantas modificadas capazes de gerar seus próprios fertilizantes também podem ser criadas usando a presente técnica de modificação genética.

Organismos modelos transgênicos são desenvolvidos para testar diferentes parâmetros – a função de certos genes pode ser determinada pelo desenho do microorganismo transgênico e modelos animais.

Patógenos prejudiciais e passados inseticidas podem ser destruídos usando microorganismos geneticamente modificados capazes de degradar toxinas.

Aplicações medicinais:

Drogas de baixo custo, hormonas, enzimas e vacinas são criadas usando ferramentas de engenharia genética.

O factor anti-coagulante é o melhor exemplo em que a enzima activadora do plasminogénio, capaz de dissolver o coágulo sanguíneo, é artificialmente concebida e utilizada nos pacientes com doença arterial coronária ou ataque cardíaco.

Outros exemplos são duas outras proteínas terapêuticas somatostatina e linfocinas que são trabalhadas contra várias condições de doença e podem ser sintetizadas artificialmente. A insulina é ainda um exemplo clássico de uma proteína terapêutica desenhada usando tecnologia de engenharia genética.

Um gene para insulina é isolado por digestão de restrição ou através de PCR e inserido no plasmídeo. O ADN plasmídeo recombinante é imediatamente inserido na célula bacteriana ou levedura na qual o plasmídeo se está a multiplicar. À medida que o microrganismo começa a dividir-se, começa a produzir insulina artificial.

Uma grande quantidade de insulina produzida usando a mesma técnica à escala industrial. O esboço detalhado da produção de insulina é mostrado na figura abaixo,

A produção comercial de insulina começou após a aprovação da FDA em 1982.

Vacinas recombinantes:

Vacinas contra a varíola, vírus do herpes simples e hepatite são produzidas usando a técnica da engenharia genética. As vacinas são as partículas virais inativadas utilizadas para induzir uma resposta imunológica contra esse patógeno, no entanto, a chance de contaminação é alta.

Usando a tecnologia do DNA recombinante, os cientistas criaram um tipo único de vacinas que contém apenas o DNA para a proteína do revestimento viral, assim o patógeno nunca mais pode ser activado. A sua principal vantagem é que é mais segura, livre de contaminação e mais reactiva.

Genetic engineering in gene therapy:

Utilizando a terapia genética ou técnica de transferência genética, os distúrbios genéticos herdados podem ser curados. A fibrose cística, a distrofia muscular de Duchenne e a anemia falciforme como as terapias genéticas estão agora na fase final do ensaio clínico e prontas para serem usadas nos pacientes.

Na terapia genética, um gene defeituoso, não funcional ou mutante é substituído pelo do tipo selvagem usando a mesma técnica explicada acima.

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Cobrimos artigos incríveis sobre terapia gênica, leia aqui:

1. Terapia Genética: Tipos, Vectores , Processo, Aplicações e Limitações.
2. O que é a Terapia Genética? e como funciona?

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3. Terapia genética mediada por DNA nu
4. Sistema Transposon de Beleza Adormecida: O Futuro da Terapia Genética

Além disso, a tecnologia da engenharia genética é igualmente utilizada na produção de biocombustível, doenças, bioálcool e outros produtos essenciais.

Limitações da engenharia genética:

Existem questões éticas associadas ao uso de terapia genética e produtos de engenharia genética.

Tambem, para fornecer um valor económico ao produto alimentar ou qualquer produto GM, os valores nutricionais estão comprometidos.

Por causa do efeito adverso do mesmo, novas cepas patogênicas resistentes são desenvolvidas mais rapidamente.

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Os efeitos secundários da terapia genética e o uso de vírus na mesma são também prejudiciais para o organismo alvo.

A tecnologia é mais cara, pois a terapia genética custa até 50.000 USD.

Conclusão:

A reprodução com o embrião ou feto é contra a lei natural, as pessoas acreditam fortemente nela, assim os alimentos geneticamente modificados e os produtos vegetais estão sempre a tornar-se um centro de controvérsia.

No entanto, usando ferramentas de engenharia genética como a terapia genética e a técnica de transferência de genes, doenças hereditárias e câncer como doenças letais podem ser prevenidas. O uso positivo de técnicas de engenharia genética pode mudar o destino da humanidade.

Fontes:

1. National Research Council (US) Committee on Identifying and Assessing Unintended Effects of Genetically Engineered Foods on Human Health. Segurança dos Alimentos Geneticamente Projetados: Abordagens para Avaliação de Efeitos Não Intencionais sobre a Saúde. Washington (DC): National Academies Press (US); 2004. 2, Methods and Mechanisms for Genetic Manipulation of Plants, Animals, and Microorganisms.
2. Wallace RB. Princípios de Manipulação Genética. Uma introdução à engenharia genética. Estudos em microbiologia. Am J Hum Genet. 1981;33(4):652-653.