Resultados e Discussão

As estruturas e energias de vários sistemas modelo mutantes do KSI foram investigadas ao longo de três etapas de reação: primeiro, abstracção do próton C4-β (ES → TS1 → EI1); segundo, ligeira rotação do próton do Asp-40 (EI1 → TS2 → EI2); e terceiro, doação do próton à posição C6-β pelo Asp-40 (EI2 → TS3 → EP), como mostrado na Fig. 1. O perfil energético previsto da WT (Fig. 2A) é semelhante ao perfil experimental correspondente de Pollack e colegas de trabalho (25). Deve-se notar que no TS2 o substrato é parcialmente neutralizado à medida que os átomos de H dos resíduos catalíticos se aproximam do oxianião (O3) no substrato e o excesso de elétrons se transfere do substrato para os resíduos catalíticos adjacentes através dos caminhos de ligação em H. Assim, o substrato, Tyr-16/57 e Asp-103 partilham uma unidade de carga negativa, e as suas distribuições de carga dependem das afinidades dos prótons e dos electrões dos resíduos catalíticos dos mutantes. Este estado TS2 com resíduos catalíticos é contrastado com aquele sem resíduos catalíticos em que o substrato é carregado negativamente por quase uma unidade.

As nossas estruturas tridimensionais calculadas de EIs (complexadas com equilenina em vez de esteróide) correspondem quase exactamente às estruturas de raios X de PI(g′) e TI(g′). Na estrutura prevista do complexo Tyr-16/57 + Asp-103 + equilenin, as duas distâncias dos valores d(O3-Or) para Tyr-16 e Asp-103 (2,54 e 2,55 Å, respectivamente) estão em boa concordância com os dados de raios X (2,6 ± 0,1 Å para ambos no caso da PI e 2,58 ± 0,08 Å e 2,62 ± 0,07 Å, respectivamente, no caso da TI) (32, 33, 36). Como as estruturas calculadas foram otimizadas sem restrições, a correspondência nas geometrias experimental e teórica indica que na enzima os principais resíduos têm interações quase máximas com o substrato sem tensão.

Conjectou-se que em solução o local ativo da TI pode ter a estrutura diádica (Asp-99… Tyr-14… equilenin) (29), que é diferente das estruturas de raios X da TI e da PI (32, 33). No entanto, uma experiência recente de RMN para PI/equilenina indicou que, em PI(D40N)/equilenina, uma ressonância forte característica de baixo campo aparece a 16,8 ppm, e uma fraca a 13,1 ppm (36), semelhante ao caso em TI/equilenina pelos grupos de Mildvan (29) e Pollack (25). Este resultado também é demonstrado pelos nossos cálculos ab initio de Tyr-16/57 + Asp-103 + complexo equilenin, onde a forte ressonância down-field a 16,5 ppm é atribuída ao Tyr-16. A experiência também mostra que, no mutante D103L + D40N, uma forte ressonância down-field (atribuída ao Tyr-16) aparece, enquanto que no mutante Y16F + D40N a forte ressonância desaparece. Assim, este experimento exclui claramente a estrutura dyadic onde a forte ressonância down-field foi atribuída ao Asp-103, que é ligada em H ao Tyr-16 (36).

As constantes de taxa absoluta podem ser investigadas usando as barreiras de ativação calculadas. Nos níveis B3LYP/6-31+G* e MP2/6-31+G*, a barreira de ativação do WT do KSI é um pouco subestimada, em comparação com a barreira experimental (10 a ≈11 kcal/mol) relatada por Pollack e colegas de trabalho (46). Entretanto, quando se considera o efeito do meio dielétrico do KSI (31), a barreira de ativação do WT é de 8,2 kcal/mol, em estreita concordância com o valor experimental. Uma ligeira subestimação de 2-3 kcal/mol poderia ser explicada com um cálculo mais preciso e um sistema modelo mais completo incluindo resíduos apolares em torno do local ativo. Em contraste com a barreira de ativação absoluta, as barreiras de ativação relativa entre diferentes mutantes e, portanto, o mecanismo de reação são bastante consistentes independentemente do nível de cálculo, devido ao efeito de cancelamento entre diferentes sistemas modelo com ambientes similares. Assim, utilizando barreiras de ativação relativa entre diferentes mutantes, obtivemos a reatividade relativa (a razão entre a constante de taxa cinética de um mutante e a do WT) ou log(kcat/kcat(WT)) com a suposição de que a transferência do ES para o TS1 é o passo determinante da taxa ao longo das trajetórias de reação (ver a nota de rodapé da Tabela 1). Os cálculos de MP2 reforçam os resultados obtidos ao nível de B3LYP. Os valores previstos de log(kcat/kcat(WT)) estão em boa concordância com os valores medidos para PI (32-35) e TI (25-28, 31) (Tabela 1). Dado que a estrutura tridimensional (terciária e quaternária) altamente homóloga e o ambiente do local ativo da TI são semelhantes aos da PI, espera-se que as reações catalíticas nos dois KSIs procedam da mesma forma.

Fig. 2 mostra os perfis de energias e distâncias de ligação H para vários mutantes ao longo da trajetória de reação. Os perfis gerais de energia (ΔE) (Fig. 2A) são quase simétricos em relação ao TS2. As barreiras do primeiro e terceiro passos são semelhantes. O segundo passo, que tem uma pequena barreira (≈1 kcal/mol), não pode ser determinante da taxa porque envolve apenas um ligeiro deslocamento do átomo H através de uma rotação mínima (apenas em vários graus porque o Asp-40 é altamente inclinado contra o plano do substrato) sobre uma ligação C-C (ou ligação C-H nas Figs. 1 e 3). Assim, a reação pode praticamente ser considerada como um mecanismo de dois passos. Os resíduos catalisam a primeira etapa doando (parcialmente) um próton ao substrato (como um ácido), enquanto a terceira etapa é catalisada pela aceitação (parcial) de um próton do substrato (como uma base). Consulte as distâncias interoxigenadas das ligações H e a distância descentrada de um próton compartilhado do ponto médio de O3 e Or em que o valor positivo/negativo indica que o próton está próximo de resíduos/substrato.

Para resíduos ácidos com menor afinidade de prótons (pA na fase gasosa ou pKa no meio dielétrico), a barreira de ativação seria menor para o primeiro passo e maior para o terceiro, enquanto que resíduos básicos com pA ou pKa maior produziriam um efeito contrário. Consequentemente, no mecanismo enzimático de dois passos, a potência catalítica ótima é obtida quando os resíduos da enzima desempenham um papel duplo de doador/aceitador de prótons muito forte de/para o substrato, alternativamente (a ser nomeado como catalisador de ácido anfídrico/base ou tampão próton/elétron) para a reação geral. No meio dielétrico das enzimas, o efeito catalisador máximo é obtido no caso de pKas iguais de resíduos e substrato . Esta situação está em contraste com as reacções de passo único em que uma grande diferença em pKa aumenta a reactividade (47, 48). A condição de pKas igual entre resíduos e substrato para o efeito catalítico máximo corresponde à exigência dos resíduos em enzima de possuir pKas equivalentes com o substrato para formar o SSHB máximo (4-7, 15, 23, 24). Assim, no mecanismo de reação em duas etapas do KSI, os SSHBs como catalisadores de ácido-amplificador/base, juntamente com vaivéns parciais de prótons e redistribuições de carga, desempenham um papel crucial na forte estabilização das EIs por ≈15 kcal/mol na energia de estabilização impulsionada pelos resíduos e na redução da distância interoxigênio dependente da reação em relação ao estado ES.

A energia de estabilização movida por resíduos ΔΔEa está de certa forma correlacionada com o ΔdES a menos que a transferência de prótons ocorra do resíduo para o substrato (ou seja, a menos que o ΔrH esteja em uma região negativa na Fig. 2C). Portanto, a estabilização em EIs e TSs pode ser correlacionada com o encurtamento da distância da ligação H e, portanto, da força da ligação H, em relação ao estado ES. Ou seja, as ligações H normais (ou normais) (entre parceiros neutros) no ES tendem a se tornar SSHBs (envolvendo espécies iônicas) nas EIs e TS2. Assim, essas ligações curtas devem ser responsáveis por uma parte da redução da energia movida por resíduos. Quanto à transferência de prótons, o potencial no ES é um único poço para todos os mutantes, enquanto que a forma potencial (perto de EIs ou TSs) na região onde ΔrH está próxima de zero (ou seja, em torno de TS1/EI1 para c e EI1/TS2 para e e f na Fig. 2C) tem algumas características de um poço duplo. Para um pequeno valor absoluto de ΔrH (<≈0.5 Å) (Fig. 2C), a barreira para a transferência de prótons é muito pequena no nosso cálculo, e por isso as transferências de prótons no potencial do tipo double-well- só por si não podem explicar o abaixamento drástico da barreira de ativação. De fato, o caso g, no qual as características de dupla onda do potencial quase desaparecem com pouca transferência de prótons, mostra mais baixa energia do que o caso f, que envolve a transferência de prótons em um potencial de dupla onda. Por outro lado, deve-se notar na Fig. 2 D e E que, após a ocorrência das transferências de prótons, a ΔdES não é mais encurtada, mas sim ligeiramente alongada, enquanto que a ΔΔEa ainda é baixada. Assim, o encurtamento do comprimento da ligação H sozinho (ou seja, ΔdES) não pode explicar a redução drástica da barreira nas ETs e nas EIs (ou seja, ΔΔEa). Assim, a redução da barreira nas ETs e nas EIs precisa ser explicada por forças adicionais de interação, que serão discutidas em termos de interações moleculares orbitais (MO) entre substratos e resíduos (envolvendo rearranjos eletrônicos induzidos por transferência de carga ou redistribuição de carga).

No caso de dois resíduos concorrentes, como em f e g, a estabilização cumulativa das EIs/TSs resulta em um kcat mais avançado. No entanto, este efeito é um pouco subaditivo (ou seja, menor que a soma das energias de estabilização de cada resíduo) como resultado da redução do poder de retirada do próton do oxianião para cada resíduo, devido à presença do outro resíduo. Essa subadditividade indica que os SSHBs envolveriam transferências de carga e polarização (ou seja, interações eletrostáticas induzidas) e possivelmente ligação covalente parcial. De fato, a estabilização de EIs e TSs na presença de resíduos catalíticos decorre principalmente da deslocalização do elétron em excesso presente no local ativo por transferência de carga e polarização, o que será visto abaixo. As cargas populacionais orbitais de ligação natural efetiva (49) do substrato nos casos a, c-e, e f na TS1 são -0,57, ≈-0,43, e -0,37, respectivamente. Assim, a carga negativa do substrato é mais reduzida na presença de dois resíduos catalíticos. Esta redução decorre da transferência do excesso de elétrons do substrato para os resíduos catalíticos com grande afinidade de elétrons, que desempenham o papel de tampão para o excesso de elétrons. Embora o Asp tenha um maior poder de retirada de electrões do que o Tyr, o Tyr tem menor afinidade de electrões do que o Asp. Assim, Tyr é tão eficaz, ou ligeiramente mais eficaz do que o Asp em baixar a barreira de activação. A estabilização dos TSs e EIs na presença de resíduos catalíticos está altamente correlacionada com a diminuição da energia do excesso de elétrons, já que o espaço para acomodar o excesso de elétrons é ampliado com resíduos catalíticos além do substrato. Esta diminuição de energia está directamente relacionada com o princípio da incerteza; quanto menos localizado for o excesso de electrões, mais estabilizado é.

Os deslocamentos químicos calculados (δ) estão de alguma forma correlacionados com o menor valor de d(O3-Or) para o mesmo número de ligações H, enquanto que a presença da segunda ligação H aumenta δ devido ao efeito de rastreio melhorado. Com base nos nossos resultados, um grande valor de δ pode frequentemente ser um bom indicador da SSHB, mas δ está apenas parcialmente correlacionado com o kcat. Essa correlação diminui particularmente para δ grande (>16 ppm) ou pequeno valor absoluto de ΔrH (<0,5 Å), pois a dependência do kcat do δ foi questionada (50).

A diminuição das barreiras de ativação na presença de resíduos catalíticos é bem compreendida a partir da análise de MO (Fig. 3). A distinção marcante nos níveis de energia do TS2 MO entre a e g surge da natureza quântica do excesso de densidade de elétrons acumulados no substrato através da desprotonação pela Asp-40. A estabilização resultante da dissipação de parte da densidade de elétrons para os resíduos catalíticos deve-se ao princípio de incerteza mencionado anteriormente, que é semelhante ao que se observa no caso de um excesso de elétrons interagindo com aglomerados de água (51, 52), que é a favor de um espaço cavitário razoavelmente grande. Assim, a presença dos resíduos catalíticos (que desempenham o papel de amortecedor da carga por transferência parcial de electrões do substrato para os resíduos catalíticos) reduz drasticamente a acumulação de carga sobre o oxianião. Esta estabilização das EIs e TSs é essencialmente assistida por SSHBs. Este efeito é altamente reforçado na presença de Asp-103 e Tyr-16/57. As energias de MO do case g são assim muito inferiores às do caso a. O efeito do meio dielétrico da enzima não é tão drástico quanto o efeito do resíduo catalítico envolvendo a transferência de elétrons. Assim, os lançadores parciais de prótons e as redistribuições de carga promovidas pelos SSHBs são mais responsáveis pela diminuição dos TSs e EIs do que o efeito dielétrico da enzima. Consequentemente, o efeito catalítico resulta de uma combinação favorável de ganhos de energias eletrostáticas não induzidas e energias de interação MO (polarização, transferência de carga e energia de ligação covalente). Enquanto o primeiro resulta dos vaivéns parciais de prótons devido à presença de ligações H carregadas (e, portanto, relacionadas com a força dos SSHBs), o segundo resulta principalmente da deslocalização electrónica devido aos resíduos catalíticos, que desempenham o papel de tampão para um electrão em excesso. O ganho de energia da interação MO está intimamente relacionado com a interação enzimático-substrato adicional promovido pelo SSHB.

A energia de estabilização pode assim ser representada como a soma da energia realçada da ligação H carregada (envolvendo espécies iônicas) de EIs/TSs em relação à ligação H normal (entre parceiros neutros) do ES e o ganho de energia da interação MO devido às redistribuições de carga envolvendo a dissipação de elétrons para os resíduos catalíticos. Como os dois termos energéticos não são facilmente separáveis, é difícil estimar cada termo. No entanto, avaliamos esses termos no caso d usando o seguinte método. A partir da comparação das energias do EI1 em relação ao ES na ausência e presença do Tyr-16 (Y16), a energia de estabilização do EI1 por Y16 é de 8,7 kcal/mol. Para investigar a contribuição da interação eletrostática não induzida (que não inclui o efeito de indução eletrostática do substrato + Asp-40 (D40) sobre o resíduo Y16) para a estabilização, realizamos os cálculos do ES e EI1 no caso em que Y16 é substituído por um resíduo fantasma composto apenas de suas cargas orbitais de ligação natural (NBO) (Y16q), que foram calculadas para uma única molécula Y16 na ausência do substrato + D40. Então, o ganho de energia de interação eletrostática não induzida (ou ganho de energia eletrostática pré-organizada) é de 4,4 kcal/mol, que é responsável pelo aumento da resistência de ligação da ligação H carregada (ou seja, o próprio SSHB). Então, a diferença nas energias de estabilização entre o efeito quântico completo por Y16 e o efeito eletrostático não induzido por Y16q (4,3 kcal/mol) deve vir da energia de interação eletrostática induzida, energia covalente, etc. A interação eletrostática induzida inclui polarização e efeitos de transferência de carga. Para obter o ganho de energia eletrostática induzida, primeiro obtemos as cargas atômicas de Y16 (Y16qind), que inclui o efeito de indução na presença do substrato + D40. Em seguida, realizamos os cálculos do ES e EI1 no caso em que Y16 é substituído por um resíduo fantasma (Y16qind) composto apenas por suas cargas atômicas de ponto atômico. Como esta energia de estabilização é 8,2 kcal/mol, o ganho de energia electrostática induzida pela interacção entre o substrato + D40 e Y16 é de 3,8 kcal/mol. Assim, o ganho de energia pela transferência de carga e polarização é grande e comparável ao ganho de energia eletrostática não-induzida. O resíduo Y16 desempenha papéis catalíticos importantes de tampão de carga para retirar e manter uma grande parte do excesso de carga negativa no substrato, bem como da correspondente redistribuição eletrônica de carga durante a reação. Esta energia eletrostática induzida surge da energia de interação MO pela interação da carga eletrônica quântica mecânica entre o resíduo catalítico (Y16) e o substrato + D40 (ou seja, a energia de interação resíduo do substrato acionada por SSHB). Finalmente, a contribuição energética restante de 0,5 (= 8,7 – 8,2) kcal/mol poderia corresponder principalmente à energia covalente não eletrostática. Esta energia é bastante pequena, o que é ainda corroborado pela nossa análise de MO que a sobreposição orbital não eletrostática no próprio SSHB não é significativa.

Em enzimas envolvendo mecanismo de reação em dois estágios, um substrato não é totalmente carregado negativamente, mas é parcialmente aniônico com dissipação de elétrons para os resíduos catalíticos. Assim, neste caso o incremento de energia de estabilização (≈10 kcal/mol a EI1) impulsionado pelo SSHB em relação à ligação H normal acaba não sendo pequeno . Se a energia SSHB for estendida para incluir as interações substrato-resíduo devido a redistribuições de carga tanto no substrato quanto no resíduo, é a energia de estabilização que é a soma da energia SSHB pré-organizada e da energia de interação MO orientada por SSHB. Entretanto, se considerarmos apenas a força da própria SSHB, o incremento da energia de ligação é muito reduzido (para ≈5 kcal/mol).