Caracterização matemática da dinâmica do TA

A dinâmica do TA é ditada pela forma como seus componentes são espacial e temporalmente organizados no promotor. Como a TA pode assumir muitos estados de configuração distintos e a evolução do estado é essencialmente estocástica, envolvendo numerosas moléculas e interações complexas, empregamos as teorias da estatística e da probabilidade para investigar a dinâmica da TA. Para simplificar, assumimos que as concentrações de espécies associadas à transcrição, como os GTFs, permanecem constantes em torno do gene modelo e as interações moleculares envolvendo o promotor estão em equilíbrio dinâmico. O termo “equilíbrio dinâmico” não significa que as interações moleculares são todas reversíveis, mas apenas que a AT deve recuperar o seu estado atual após algum tempo. Um gene modelo e todas as espécies que o rodeiam constituem um sistema. As suposições acima implicam que tal sistema está em um estado estável. Consideremos um conjunto estatístico composto por um grande número de sistemas essencialmente idênticos, com cada um evoluindo independentemente. O número de sistemas é suficientemente grande para que todos os estados de configuração possíveis da TA possam ser cobertos por este conjunto. Ou seja, cada estado submetido a um gene individual mapeia os estados de outros genes no conjunto e a proporção de genes num estado especial X (por exemplo, genes com os seus melhoradores ligados por activadores), P(X), permanece constante ao longo do tempo. Da mesma forma, se um gene individual é observado a qualquer momento, a probabilidade de que o gene esteja no estado X também é P(X). Neste sentido, em que estado um gene individual está localizado é um evento aleatório.

Para o modelo mínimo (Fig. 1a), definimos todos os estados de configuração da TA como um conjunto universal Ω e os vários estados com as mesmas características chave dos seguintes subconjuntos, respectivamente (Fig. 1b). A denota que o melhorador é ligado por um ativador. S denota que o promotor do núcleo está vinculado pelas proteínas do SCF. M denota que um mRNA nascente está em gestação (incluindo o processo de formação do PIC até a fuga do Pol II para o alongamento). J denota que o ativador intensificador é conjeturado ao SCF, PIC ou OPC através do Mediador. Porque a iniciação transcripcional eucariótica requer a presença do SCF no promotor central4,12, M⊂S. De acordo com as definições, J⊂AS. No conjunto MJ, M e A são simultâneos, ou seja, os ativadores intensificadores podem afetar diretamente a ação do Pol II através do Mediador. Assim, a iniciação transcripcional sob regulação direta dos ativadores é descrita pelo conjunto MJ, enquanto que a iniciação transcripcional basal, independente do ativador, está incluída no conjunto M-J. A probabilidade de um mRNA nascente em gestação, ou seja, a probabilidade de que um mRNA seja gerado, é

onde q é uma constante representando a iniciação transcripcional basal e Aj é um subconjunto de A (ver S1 de Informação Suplementar para detalhes). Em AJ, os ativadores intensificadores são obrigatórios para o contato com o SCF-, PIC-, ou Mediador Juntado ao OPC. A equação (1) caracteriza a relação entre a produção de mRNA e as propriedades dinâmicas do TA.

Codificação da concentração de ativadores transcripcionais

Devido a arquiteturas distintas de cromatina promotora em diferentes estágios transcripcionais, os ativadores vinculados ao intensificador podem desempenhar várias funções, tais como promover a acetilação do histórico e recrutar GTFs4,5,15. Especificamente, o conjunto Aj envolve os ativadores intensificadores-atuadores que são responsáveis por lidar com a maquinaria transcripcional basal e controlar a iniciação transcripcional. Além disso, as atividades destes ativadores também estão associadas à codificação da concentração nuclear dos ativadores, pois é o único fator na equação (1) dependendo da concentração dos ativadores. Aqui, investigamos a dinâmica desses ativadores.

Activadores se movem rapidamente dentro do núcleo e a probabilidade de eles atingirem o intensificador é proporcional à sua abundância nuclear9. Consideremos um período de tempo, durante o qual os ativadores envolvidos no conjunto Aj se ligam e depois partem do realçador por m (m = 1, 2, 3, …) ciclos. Definimos a taxa de ocupação temporal RTOR desses ativadores como , onde e denotam, respectivamente, o tempo de ligação e de des ligação do j-ésimo ciclo. Para o número fixo na de ativadores no núcleo, temos

onde aon e aoff são as funções de propensão de encadernação e desencadernação, respectivamente (ver S2 de Informação Suplementar para detalhes). aon é uma função de na, enquanto aoff é independente de na. A equação (2) indica que à medida que m sobe, converge para um valor determinístico, que é uma função monotonicamente crescente de na (Fig. 1c-d e Fig. S1; esta é uma propriedade geral e pode ser aplicada a casos em que o número de sítios de ligação cognata no intensificador é maior que um (ver equações S13-S18)). Esta convergência implica que mesmo a concentração variável no tempo dos ativadores pode ser codificada pela RTOR, desde que os ativadores liguem e desliguem o realçador com freqüência suficiente ao longo de uma janela de tempo com sua concentração quase inalterada. De fato, existem mecanismos de dissociação ativa que garantem o ciclo rápido dos ativadores9,19,20,21,22. O tempo de ligação foi estimado dentro do intervalo de segundos a dezenas de segundos9,10. Além disso, foi provado no gene endógeno CUP1 que tal ciclagem rápida é funcional10. Presumivelmente, a RTOR codifica a concentração de ativadores transcripcionais. Por outro lado, durante o período de tempo em que os ativadores ligam e desligam o ativador para m vezes, a probabilidade de que o ativador esteja ligado por tal ativador é . Como a média de sobre o conjunto também é f(na), temos

As condições de restrição garantindo respostas transcripcionais confiáveis

Dada a estocasticidade na ocorrência de eventos transcripcionais, para alcançar uma resposta transcripcional confiável requer que o código RTOR, que representa oportunamente a concentração de ativadores, deve ser transduzido com alta fidelidade na quantidade de transcrições. Idealmente, se P(S), e todos iguais a 1, a transdução exata de informação seria realizada. A seguir, apresentamos as condições nas quais esses três fatores podem ser suficientemente grandes para assegurar respostas transcripcionais confiáveis na presença de flutuações aleatórias (Figs. S2 e S3 fornecem explicações intuitivas para esta subseção).

Equação (3) implica que a concentração de ativadores não pode ser suficientemente codificada sem a persistência do SCF sobre o promotor. Assim, o SCF deve montar rapidamente quando a arquitetura cromatina permite e ser muito mais estável que os ativadores intensificadores (Condição I). Tal estabilidade do SCF foi observada experimentalmente e o tempo de ligação do TBP (TATA-binding protein, o componente central do SCF) no promotor pode ser de até 20 min em células humanas11. Para , Aj é uma pré-condição para a ocorrência de J. Como RTOR é determinado pelos curtos tempos individuais de ligação dos ativadores, J deve acontecer imediatamente após a ocorrência de Aj (Fig. S3). Caso contrário, a informação sobre RTOR é largamente perdida ou mesmo falsamente utilizada para a iniciação transcripcional direta (note que J é uma pré-condição de M). Portanto, para transferir corretamente o código RTOR, o Mediador deve agir esperando para ligar os ativadores de ciclismo e transmitir a informação através da alosteria23,24,25 (Condição II). Isto porque outros tipos de interações moleculares como as colisões livres não podem transmitir com precisão a informação sobre o tempo de ligação dos ativadores. Tal alosterismo do Mediador é apoiado pelo trabalho anterior26. determina como a informação sobre RTOR herdada por J é convertida para guiar a quantidade de transcrições. Como a RTOR depende da ligação intermitente dos ativadores, uma grande requer que durante os curtos períodos de ligação, transcrições devem ser produzidas a uma taxa bastante rápida (Fig. S2) (Condição III). Esta característica também é verificada por estimativas computacionais dos dados experimentais (ver S3 de Informações Suplementares). Portanto, todas as três condições podem ser satisfeitas naturalmente.

O mecanismo dinâmico da transcrição regulada pelo ativador

As três condições de restrição acima, juntas, determinam como a TA funciona. Repetitivamente surge um estado em que se forma um espaço relativamente estável em forma de braçadeira entre o Mediador e o intensificador (Fig. 2; de acordo com as Condições I e II). Como o SCF demonstrou experimentalmente não ser muito estável11 , esse espaço é construído temporariamente. O espaço tipo pinça atrai ativadores livres e depois os descasca rapidamente, com RTOR decidida pela concentração dos ativadores (de acordo com as equações (2-3)). Quando uma molécula ativadora entra neste espaço, surge a alosteria no Mediador, resultando em uma circunstância facilitada para que os GTFs e outras proteínas relacionadas realizem suas funções. Consequentemente, o Pol IIs pode iniciar/reiniciar a transcrição muito rapidamente (de acordo com as Condições II e III), com a RTOR a reger a quantidade de transcrições.

Ilustração do mecanismo dinâmico para a AT orquestrando uma resposta transcripcional confiável.

Repetitivamente surge um estado em que se forma um espaço semelhante a uma pinça relativamente estável entre o Mediador e o intensificador. Os ativadores transcripcionais entram e saem rapidamente deste espaço. Somente quando este espaço é ocupado por ativadores é que os Pol IIs iniciam/reiniciam a transcrição a um ritmo mais rápido do que o ciclo dos ativadores.

Este mecanismo sugere que as interações moleculares envolvendo o promotor obedecem a elegantes princípios dinâmicos como se segue. Enquanto o espaço do tipo pinça é formado temporariamente, ele é muito mais estável do que os ativadores nele instalados. Os ativadores podem circular dentro e fora do espaço por muitas vezes, mesmo durante episódios curtos, quando sua concentração permanece quase inalterada; assim, a concentração de ativadores pode ser representada por RTOR oportunamente. Como o Mediador transmite a informação via alosteria e a taxa de reiniciação transcripcional é muito maior do que a taxa de ciclos dos ativadores, o código RTOR é efetivamente empregado para direcionar a síntese do mRNA. Em uma palavra, o espaço em forma de pinça é a base estrutural para respostas transcripcionais confiáveis. Em vez de ser um obstáculo, a natureza estocástica das interações moleculares é plenamente utilizada para induzir a transcrição de forma confiável; isto depende em grande parte de diferentes extensões da estabilidade dos componentes da AT, que abrangem várias ordens de magnitude. Os argumentos acima são suportados por dados experimentais e as escalas de tempo típicas são as seguintes: a meia vida útil do espaço tipo pinça é de cerca de 5 min11, o tempo de ocupação dos ativadores no espaço está dentro do intervalo de segundos a dezenas de segundos10, a alosteria geralmente ocorre dentro do tempo de milissegundos a não mais do que 1 segundo23,24,25 e leva apenas vários segundos para reiniciar uma transcrição (ver S3 de Informações Suplementares).

Validação do mecanismo por simulações numéricas

Para verificar melhor o mecanismo dinâmico proposto, construímos um modelo estocástico simplificado de transcrição de genes com parâmetros fisiologicamente realistas (ver Fig. S4 e S4 das Informações Suplementares para detalhes). Este modelo descreve as principais transições de estado da TA e também descreve simplesmente a dinâmica cromatina relacionada, sendo assim capaz de caracterizar a resposta transcripcional aos ativadores transcripcionais. A seguir, a “entrada” e a “saída” denotam a concentração nuclear dos ativadores e a quantidade de produtos gênicos, mRNA ou proteína, respectivamente.

Primeiro, exploramos a evolução temporal do número de mRNAs celulares em níveis constantes de entrada (Fig. 3a). Notavelmente, os mRNAs são produzidos de forma semelhante ao estouro, consistente com a visão predominante14,27,28,29,30,30,31,32. Para entradas de baixo nível, um alelo é transcrito enquanto o outro é silencioso em uma célula diplóide e, portanto, o fenômeno de estouro é aparente. Para os inputs de alto nível, no entanto, ambos os alelos estouram frequentemente, de modo que a soma se torna quase constante. Isto sugere que o fenótipo de respostas transcripcionais elevadas persistentes pode ser observado em altos níveis de entrada14,

Respostas transcripcionais aos ativadores baseadas no mecanismo dinâmico proposto.

A entrada é igual a aon/aoff, o que está positivamente relacionado com a concentração nuclear dos ativadores. (a) Evolução temporal do número de mRNAs celulares em uma única célula diplóide com diferentes níveis de entrada. mRNAs produzidos por dois alelos são mostrados separadamente em vermelho e preto. O estouro transcripcional torna-se denso com o aumento da força de entrada. (b) A relação média de entrada/saída em células diplóides individuais. As saídas máximas são normalizadas para 1. As barras de erro denotam o desvio padrão da saída, SDout. O inset mostra a relação de SDout para a saída média vs. a entrada. Como a abundância de mRNAs ou proteínas também depende das suas taxas de degradação/inactivação, que são moduladas pela sinalização celular, a taxa de produção de mRNA reflecte mais directamente a dinâmica da TA (ver também Fig. S9, onde a taxa de produção de proteínas também é mostrada44,45). (c) As curvas do SDout vs. a entrada. Estas curvas quase se mantêm em forma de sino mesmo com várias taxas de degradação de mRNAs ou proteínas (ver também Fig. S10). (d) A distribuição dos níveis de mRNA por uma população celular para diferentes níveis de input. O tamanho do depósito é 10. (e) A evolução do estado de um promotor em resposta a um input periodicamente variável. G1 denota que o promotor é ligado por um ativador. SCF denota que o promotor do núcleo é vinculado pelo SCF. OPC denota que o promotor do núcleo está no estado OPC. As curvas descrevem a entrada, os estados correspondentes do promotor e a produção de mRNAs (de cima para baixo), respectivamente. (f) Simulação ChIP da resposta transcripcional. A entrada e os símbolos são os mesmos que no painel (e). TATAn e Pol II denotam que o promotor central está vinculado por histones e Pol II, respectivamente.

Uma análise experimental recente excluiu a possibilidade de o ambiente cromatinado desempenhar um papel central na formação do rebentamento transcripcional32. Aqui, demonstramos que uma explosão de transcrições se origina de reiniciação persistente por Pol IIs quando o espaço tipo pinça é ocupado pelos ativadores (Fig. 4). Ou seja, a iniciação do mRNA é em si mesma semelhante ao estouro. O estouro não é mero ruído; ao contrário, é uma manifestação direta do código RTOR, que representa a concentração de ativadores e guia a produção de mRNA.

A essência do estouro transcripcional.

Mostrada é uma visão microscópica de um estouro transcripcional. CA’ denota que um ativador está no espaço em forma de pinça. ‘OPC’ denota que a máquina de transcrição está no estado OPC (um painel de zoom-in também é exibido). Quando uma molécula ativadora está presente no espaço do tipo pinça, a reiniciação transcripcional rápida resulta em um estouro de mRNAs.

Segundo, investigamos a relação média de entrada/saída da resposta transcripcional. A saída média se assemelha a uma função Hill da entrada, que é amplamente utilizada em biologia de sistemas para modelar a expressão gênica3,33,34 (Fig. 3b). A curva do desvio padrão SDout do output em relação à entrada é aproximadamente em forma de sino (Fig. 3c). A intensidade do ruído intrínseco, definida como a relação entre o SDout e o output médio35 , é inversamente correlacionada com a entrada (o conjunto da Fig. 3b). Além disso, as características acima são insensíveis às leves flutuações na entrada (ou seja, ruído extrínseco) (Fig. S5), sugerindo a robustez da resposta transcripcional ao ruído. Todos estes resultados estão em boa concordância com as medidas experimentais tanto em embriões Saccharomyces cerevisiae36 como em embriões Drosophila37. Particularmente, o lado esquerdo da curva SDout é inferior ao seu lado direito; esta característica está quase quantitativamente de acordo com os dados experimentais37 (ver S5 de Informações Suplementares para maiores discussões). Em contraste, desvios dos princípios dinâmicos propostos acima (incluindo as circunstâncias nas quais a ciclagem dos ativadores é lenta, o complexo do andaime/espaço tipo grampo não é estável, ou/e a taxa de reiniciação transcripcional é baixa) reduziria a capacidade da AT de responder com confiabilidade à entrada (Fig. S6).

A relação entrada/saída observada nos embriões de Drosophila foi acreditada pela máxima utilização do limite de interações moleculares37,38,39. As propriedades de tais interações microscópicas são integradas para serem macroscopicamente manifestadas como SDout. A curva SDout é ainda em forma de sino, em comparação com a curva SDin (cf. Fig. 1d). Ou seja, a assinatura do código RTOR pode ser transmitida diretamente para a saída. Isto confirma que a taxa de ocupação temporal dos ativadores é realmente explorada para regular a transcrição e o Mediador transmite a informação através da alosteria. Por outro lado, a curva SDout é assimétrica, sendo o lado direito mais alto do que o esquerdo. A razão é óbvia. Quando a entrada é muito alta, o intensificador é ligado pelos ativadores quase o tempo todo e assim as flutuações refletem principalmente as propriedades dinâmicas do SCF e a reiniciação transcripcional por Pol IIs. Nossas simulações posteriores mostram que o lado direito da curva SDout cai conforme a estabilidade do SCF ou a taxa de reiniciação transcripcional é aumentada; somente quando aumenta sua força além das faixas fisiológicas é que a curva pode se tornar simétrica (Fig. S6F). Isto também verifica que ambos P(S) e são de fato suficientemente grandes. Portanto, as propriedades do SDout devem provar conclusivamente o mecanismo transcripcional microscópico.

Estrito, sondamos a distribuição dos níveis de mRNA em uma grande população de células expostas à mesma entrada (Fig. 3d). Para entradas pequenas, o fenômeno de estouro é especialmente óbvio e a maioria das células não tem mRNAs ou tem poucos mRNAs. Isto é consistente com a observação experimental27,30,31. Mas a distribuição torna-se gradualmente normal à medida que o input aumenta. Para aon/aoff >1, a distribuição torna-se mais acentuada com o aumento do input. Estes resultados aguardam identificação experimental.

Quatro, simulamos a resposta transcripcional a um input periodicamente variável. O processo microscópico em um promotor é bastante dinâmico e estocástico, com diferentes componentes do AT exibindo estabilidades distintas (Fig. 3e). No entanto, a quantidade de mRNAs pode seguir a entrada. Estes resultados estão de acordo com os resultados revelados pelo FRAP, ou seja, o TA é um aparelho altamente dinâmico8,10,11,22. Por outro lado, as simulações dos ensaios de imunoprecipitação de cromatina (ChIP), que caracterizam a evolução temporal da distribuição dos diferentes estados do promotor entre uma população celular, revelam uma forte regularidade nas distribuições (Fig. 3f). Os padrões tanto dos ativadores ligados ao ativador quanto do SCF e Pol II ligados ao promotor seguem a entrada. transcrições de mRNA são produzidas em fase com a entrada, enquanto as histórias ocupam o promotor em fase reversa. Todos estes resultados são bem consistentes com os resultados experimentais22,40. Portanto, as discrepâncias observadas entre os resultados dos experimentos FRAP e ChIP podem ter origem em diferentes resoluções envolvidas nas medições. As medidas de ChIP integram interações moleculares tanto temporalmente quanto sobre a população celular, enquanto o FRAP reflete de forma mais rigorosa as interações instantâneas. Além disso, a resposta transcripcional à entrada variável no tempo é robusta ao ruído extrínseco, mas sensível a sinais de entrada compostos e desvios dos princípios dinâmicos (como os casos com baixa taxa de ciclos de ativadores, o complexo instável de andaimes/espaço tipo grampo, ou/e baixa taxa de reiniciação transcripcional) reduziria a capacidade de resposta (ver Figs. S7 e S8).