Geração de ratos knockout

Tecnologias utilizadas para gerar ratos knockout incluem a recombinação homóloga (ou o alvo do gene) e a armadilha genética. Ambas as abordagens envolvem o uso de células estaminais embrionárias de camundongos (ES) que são isoladas de embriões de camundongos cerca de quatro dias após a fertilização. Na primeira abordagem, a recombinação homóloga, o DNA artificial com sequências de flanco homólogas (idênticas) às que ocorrem a montante e a jusante da sequência de DNA do gene alvo é introduzido no núcleo de uma célula ES do rato. A célula ES reconhece as sequências de flanking homólogas e troca o ADN do gene alvo existente por segmentos do ADN estranho. O DNA estranho, entretanto, está inativo. Assim, a sua incorporação no genoma da célula ES inactiva, ou elimina, o gene alvo. O DNA estranho normalmente é projetado para carregar um gene repórter, que marca ou marca a localização do gene existente, permitindo aos pesquisadores rastrear sua presença no genoma da célula do rato à medida que as células se replicam. A recombinação homóloga é o método de escolha quando é necessário que um alelo específico (gene) seja substituído por uma sequência de DNA projetada sem afetar nenhum outro gene no genoma.

A armadilha do gene também faz uso de DNA artificial que carrega um gene repórter. Entretanto, ao invés de visar um gene específico, o DNA estranho é incorporado aleatoriamente em qualquer gene do genoma da célula ES do mouse. A sequência estranha impede que o gene perturbado codifique seus produtos protéicos, tornando assim o gene inativo. A ativação do gene transmissor ao ser incorporado ao genoma da célula ES permite aos pesquisadores rastrear a atividade do gene e deduzir a função do gene perturbado.

Seqüências artificiais de DNA tipicamente são introduzidas nas células ES do rato usando um retrovírus ou outro vetor viral, e as células ES modificadas são então cultivadas em culturas de células. Após alguns dias, as células são injetadas em embriões precoces de camundongos, que posteriormente são implantados no útero de uma fêmea substituta, onde eventualmente se desenvolvem e são levados a termo. Os filhotes de camundongos nascidos desta forma contêm tecido modificado e não modificado e, portanto, não são ratos nocturnos completos. Para gerar um par de ratos verdadeiros nocturnos (nocturnos homólogos), os ratos devem ser criados ao longo de várias gerações. Inicialmente, os animais são cruzados com outros ratos para produzir indivíduos heterozigotos (ratos com uma cópia do gene alvo); os animais heterozigotos são então cruzados para produzir homozigotos.