Isozyme tipo I

Como evidenciado na Fig. 1,a hexoquinase serve como a porta de entrada da Glc para as vias alternativemetabólicas. No entanto, é provavelmente seguro dizer que a hexoquinase é a mais comumente considerada como uma enzima glicolítica, e o metabolismo glicolítico é genericamente considerado um processo citoplasmático. Assim, foi notável que, ao contrário de outras enzimas glicolíticas, a atividade da hexoquinase (agora conhecida como isozima TypeI) foi encontrada predominantemente em ‘frações particuladas’ de brainhomogenatos (Crane e Sols,1953). Trabalhos posteriores (Johnson, 1960; Rose and Warms, 1967; ver também Wilson, 1995) demonstraram que a hexoquinase particulada estava associada à mitocôndria e, mais especificamente, à membrana mitocondrial externa (Rose and Warms, 1967; Kropp and Wilson, 1970), 1992; Sui e Wilson, 1997) e isinserida no núcleo hidrofóbico da membrana mitocondrial externa no curso da ligação (Xie e Wilson, 1988). A porina (também chamada `VDAC,’ a sigla para ‘canal aniônico dependente de energia elétrica’) forma o canal através do qual metabolitos atravessam a membrana mitocondrial externa, e foi identificada como a proteína da membrana outermitocondrial que interage com a hexoquinase(Felgner et al., 1979;Lindén et al., 1982;Fiek et al., 1982). Além disso, há evidências que sustentam a visão de que a ligação da hexoquinase ocorre preferencialmente aos poros localizados em locais de contato, regiões nas quais há contato íntimo entre as membranas mitocondriais interna e externa(Dorbani et al., 1987;Kottke et al, 1988;BeltrandelRio e Wilson,1992a).

Os estudos clássicos de Johnson(1960) e de Rose e Warms(1967) foram logo seguidos por relatos de hexoquinase mitocondrialmente ligada a outros tecidos normais, inaddição ao cérebro, bem como de várias células tumorais (para referências, ver Wilson, 1985,1995). O potencial significado fisiopatológico desta associação de uma enzima ‘glicolítica’ com ahmitocôndria, o local primário para o metabolismo oxidativo, tem sido o subjetivo de muita especulação. Desde cedo, e particularmente após o reconhecimento de que a proteína de ligação à hexoquinase da membrana mitocondrial externa era idêntica à porina, e assim a hexoquinase poderia ser posicionada perto do ponto em que a ATP sairia da mitocôndria (e a ADP reentraria na mitocôndria), A especulação foi amplamente focada na possibilidade dessa proximidade poder promover interação metabólica íntima entre a fosforilação oxidativa intramitocondrial como fonte de fosforilação de substrato ATP e Glc pela hexoquinase ligada mitocondrialmente. Isto foi considerado por Rose e Warms(1967), mas não pôde ser apoiado por seus resultados experimentais. Entretanto, trabalhos subseqüentes de outros (novamente, para referências ver Wilson,1985,1995), utilizando hexoquinase ligada mitocondrialmente de várias fontes, produziram evidências em apoio à visão de que a hexoquinase ligada mitocondrialmente tinha acesso ‘preferencial’ ou ‘privilegiado’ à ATP gerada intramitocondrialmente.

O trabalho em nosso laboratório forneceu uma base firme para a visão de que a hexoquinase ligada à mitocôndria cerebral fosforilizante ativa está de fato ligada a um compartimento intramitocondrial de substrato ATP, gerado pela fosforilação oxidativa. O suporte experimental para esta conclusão foi descrito em uma série de publicações (BeltrandelRio e Wilson, 1991,1992a,b;de Cerqueira Cesar e Wilson,1995,1998,2002;Hashimoto e Wilson, 2000). A revisão completa deste trabalho não é possível dentro das restrições do contexto atual, mas destacaremos alguns dos principais achados para ilustrar a variedade de abordagens experimentais, todas levando à mesma conclusão, que têm sido utilizadas nestes estudos.

Estudos iniciais (BeltrandelRio e Wilson,1991,1992a,b)foram realizados com métodos espectrofotométricos nos quais a produção de ATP por vários processos intramitocondriais (fosforilação oxidativa, adenilato kinasereação, reação creatina quinase) e a fosforilação de Glc por hexoquinase foram ligadas à produção de NADPH, monitorada a 340 nm, pelo uso de enzimas de acoplamento apropriadas. A idéia básica foi que ao comparar a taxa de fosforilação por Glc com a taxa de produção de ATP de várias fontes, pode-se deduzir a importância relativa de vários processos geradores de ATP intramitocondrial como fonte de ATP de substrato para a hexoquinase. E aconclusão foi que, quando a fosforilação oxidativa estava ocorrendo, nem a quinase de adenilato nem a quinase de creatina eram uma fonte significativa de substratoATP. Além disso, apenas uma fração do ATP produzido pela fosforilação oxidativa foi utilizada pela hexoquinase, com o resultado de que no meioextramitocondrial continuou a aumentar à medida que a fosforilação oxidativa continuou. A taxa de fosforilação Glc não aumentou constantemente em resposta ao aumento contínuo do extramitocondrial, entretanto, apesar do fato de que este último foi comparável ao Km para ATP visto com ATP extramitocondrial adicionado na ausência de fosforilação oxidativa, ou seja, a hexoquinase não teria sido “saturada” com ATP extramitocondrial como substrato (Fig. 2). Isto sugeriu fortemente que não era o ATP extramitocondrial que estava sendo utilizado como substrato.

Outro suporte para isto foi dado por resultados como os mostrados emFig. 3. Aqui, a Glcphosphorylation foi monitorada após o início da fosforilação oxidativa por adição de ADP, com concentrações crescentes de ATP extramitocondrial presentes desde o início. Como esperado da clássica Michaelis-Mentenkinetics, a taxa inicial de fosforilação de Glc aumentou com increasingextramitochondrial . Entretanto, com o tempo, foi alcançada uma taxa de fosforilação em estado estacionário, independente da quantidade de ATP extramitocondrial residual presente. Estes resultados foram interpretados como indicando que, enquanto a hexoquinase ligada mitocondrialmente utilizava inicialmente ATP extramitocondrial, o início da fosforilação oxidativa levou a uma troca na preferência do substrato, com a hexoquinase tornando-se dependente do compartimento anintramitocondrial da ATP, no qual foi determinada pelo therate da fosforilação oxidativa e independente do extramitocondrial.

Embora a produção de ATP tenha começado quase imediatamente após o início da fosforilação oxidativa pela adição de ADP, houve uma acentuada ininiciação tardia da fosforilação de Glc pela hexoquinase ligada mitocondrialmente(Fig. 3D) antes da obtenção de uma taxa de estado estacionário que persistiu por um período prolongado. Esse período inicial de defasagem foi interpretado como o tempo necessário para preencher um compartimento intramitocondrial com ATP gerado pela fosforilação oxidativa e do qual amitocondrialmente ligada à hexoquinase extraiu seu substrato ATP. A inibição do transporte de ATP por adição de KCN resultou na aparente liberação de ATP, presumivelmente do compartimento intramitocondrial, e as propriedades deste “compartimento” (cinética de enchimento, ligação à produção intramitocondrial de ATP, etc.).Infelizmente, a concordância com as expectativas não é um guia infalível para o verdadeiro efeito, e a “liberação aparente de ATP” foi posteriormente encontrada como anartifato (Laterveer et al.,1993), cuja fonte ainda não foi compreendida e que não pôde ser reproduzida em trabalhos posteriores (deCerqueira Cesar e Wilson, 1998). Apesar deste desencorajador, eembarizante, retrocesso, o conceito básico de acoplamento da mitocondrially boundhexokinase a um compartimento intramitocondrial de ATP foi apoiado por outras evidências e tem resistido a testes experimentais posteriores.

Um método de dupla marcação isotópica foi desenvolvido como alternativa aos procedimentos espectrofotométricos (deCerqueira Cesar e Wilson, 1995). 14C-Labeled Glc foi utilizado como substrato para hexoquinase, e 32Pi forneceu substrato para síntese de ATP por fosforilação oxidativa. A razão32P/14C em Glc-6-P forneceu assim uma medida da atividade específica do substrato ATP usado pela hexoquinase. A razão32P/14C da Glc-6-P produzida pela hexoquinase mitocondrial foi comparada com a produzida pela hexoquinase de levedura, que não se liga às mitocôndrias e, portanto, necessariamente utiliza aATP extramitocondrial como substrato. A cinética da marcação dos pools de ATP utilizados como substrato por mitocôndrias e hexoquinase de levedura foi surpreendentemente diferente, mais uma vez consistente com a visão de que a hexoquinase mitocondrial não estava utilizando ATP extramitocondrial como substrato, mas sim, utilizando o compartimento anintramitocondrial de ATP fornecido por fosforilação oxidativa.Por exemplo (Fig. 4), a adição de excesso de 31Pi, diminuindo assim significativamente a especificidade da 32P-ATP sintetizada pela fosforilação oxidativa, resultou em uma rápida diminuição da relação 32P/14C da Glc-6-P produzida pela hexoquinase levedura, utilizando ATP extramitocondrial. Incontraste, houve um atraso e posteriormente uma diminuição um pouco mais lenta na razão 32P/14C da Glc-6-P produzida pela hexoquinase mitocondrial. As últimas observações foram novamente consistentes com a visão de que a hexoquinase mitocondrial estava utilizando um compartimento intramitocondrial de ATP que não estava livremente equilibrado com a ATP extramitocondrial.

Still outra abordagem experimental foi baseada em uma comparação entre a hexoquinase ligada mitocondrialmente e a enzima de levedura não ligada (de CerqueiraCesar e Wilson, 1998,2002). A lógica subjacente é ilustrada na Fig. 5. Uma quantidade fixa de mitocôndria cerebral, com hexoquinase ligada, é misturada com quantidades crescentes de mitocôndria hepática de rato, que não contém hexoquinase ligada. As mitocôndrias do cérebro e do fígado são ativamente fosforilizadas e, portanto, há uma taxa crescente de produção de ATP no sistema à medida que a quantidade de livermitocôndrias é aumentada. Por projeto, a concentração de ATP extramitocondrial é mantida subsaturada, ou seja, ÅKm de hexoquinase com ATP extramitocondrial como substrato (na ausência de fosforilação oxidativa). Se a hexoquinase ligada mitocondrialmente for ATP usingextramitocondrial como substrato, é esperado um aumento progressivo na taxa de Glcphosphorylation, já que a taxa de produção de ATP é aumentada pela adição de quantidades crescentes de mitocôndrias hepáticas. De fato, isto não é o que se observa; ao contrário, a taxa de fosforilação da Glc pela hexoquinase atada amitocondrial não é significativamente afetada pelo aumento da taxa de produção de ATP (Fig.6). Em contraste, o aumento esperado na taxa de fosforilação Glc é visto se a hexoquinase mitocondrial for substituída por uma quantidade anequivalente de hexoquinase de levedura. Estes resultados são, portanto, novamente consistentes com a visão de que a hexoquinase ligada mitocondrial está usando ATP intramitocondrial, intrínseca à mitocôndria com a qual a hexoquinase está associada, mas independente de qualquer aumento da ATP intramitocondrial emanando da livermitocôndria livre de hexoquina.

Finalmente, mais evidências para a visão de que a mitocondrially boundhexokinase pode discriminar entre ATP intra e extramitocondrial vem do exame da inibição pelo análogo Glc-6-P, 1,5-anidroglucitol-6-P(1,5-AnG6P). Na ausência de fosforilação oxidativa e com ATP extramitocondrial como substrato, 1,5-AnG6P é um inibidor bastante potente, competitivo em relação ao ATP (Fig.7) (Hashimoto e Wilson,2000). Em contraste, com o ATP fornecido pela fosforilação oxidativa, o 1,5-AnG6P é muito menos eficaz como inibidor. Claramente, o ATP fornecido pela fosforilação oxidativa não é equivalente ao ATPextramitocondrial. Resultados similares têm sido relatados recentemente usando a hexoquinasemitocondrial do cérebro bovino(de Cerqueira e Wilson,2002).

Em resumo, a visão atual é que, na ausência de oxidativofosforilação, a hexoquinase mitocondrial pode usar prontamente o extramitocondrialATP, seguindo a clássica cinética de Michaelis-Menten. Durante a fosforilação ativa oxidativa, entretanto, a enzima mitocondrial ligada é acoplada a um pool intramitocondrial de ATP, com a taxa de Glcphosphorylation estreitamente correlacionada com a taxa de fosforilação oxidativa. Mudanças na taxa de fosforilação? Sim, claro, dependendo das flutuações na procura de energia. Mas verdadeiramente não-fosforilantes? Provavelmente apenas sob as circunstâncias mais terríveis – e, em última análise, letais. Segue-se que, em condições normais, a taxa de Glcphosphorylation é estreitamente coordenada com as fases terminais oxidativas do Glcmetabolismo que ocorrem nas mitocôndrias, com produção associada de ATP byoxidative phosphorylation. Como anteriormente observado (BeltrandelRio e Wilson,1992a), tal coordenação pode assegurar a introdução do metabolismo glicolítico da Glc a uma taxa compatível com os estágios oxidativos terminais, evitando a produção de lactato neurotóxico (Marie e Bralet, 1991), ao mesmo tempo em que se obtém fluxo líquido através das porções citoplasmáticas e mitocondriais da via a uma taxa adequada para atender à demanda energética(Fig. 8).

Não se sabe como essa notável alteração na especificidade do substrato (ATP intramitocondrial versus extramitocondrial) é induzida pela fosforilação oxidativa, mas é claro que a conformação da enzimamitocondrial é afetada pelo potencial da membrana mitocondrial, assim como outros fatores relacionados à função mitocondrial, indicando a interação íntima entre a membrana interna (através da qual o potencial da membrana existe) e externa (à qual a hexoquinase está ligada) desta organela (Hashimoto e Wilson, 2000).Alterações conformacionais que afetam as regiões da molécula envolvida no substrato de bindingof ATP tinham sido previamente postuladas(de Cerquiera e Wilson,1998) para serem responsáveis por alterações na especificidade do substrato.