2.2. Teste Ames

O teste Ames foi usado para investigar a mutagenicidade de Copaifera spp. A metodologia de préincubação desenvolvida por Maron e Ames, com e sem ativação exógena (S9), foi empregada para analisar diferentes cepas de Salmonella Typhimurium (TA98, TA100, TA97a e TA102), na tentativa de identificar agentes que causam mutações genéticas. As cepas testadas, gentilmente fornecidas pelo Dr. B.N. Ames (Berkeley, CA, EUA), foram cultivadas a partir de culturas congeladas durante 12-14 h, de um dia para o outro, no caldo de nutrientes oxoidais número 2.

Para o ensaio de atividade mutagênica, várias concentrações de cada oleorresina, cada extrato, ou ácido kaurenóico dissolvido em DMSO foram adicionados a 0,1 mL de cultura bacteriana em 0,5 mL de tampão fosfato 0,2 M ou 0,5 mL de 4% de mistura S9 e incubados a 37°C por 20-30 min. As concentrações variaram de 62,5 a 500 μg/placa para o C. lucens (extrato), de 120 a 1000 μg/placa para o C. multijuga (extrato), de 125 a 1000 μg/placa para o C. oblongifolia (oleoresina), de 500 a 4000 μg/placa para o C. langsdorffii (oleoresina), e de 25 a 200 μg/placa para o ácido kaurenóico. Estas concentrações foram selecionadas com base em um teste preliminar de toxicidade. Em todos os ensaios subsequentes, o limite superior da gama de dose testada foi a dose não tóxica mais elevada ou a dose tóxica mais baixa determinada no ensaio preliminar. A toxicidade foi detectada como uma redução no número de revertentes de histidina (His+) ou como um afinamento do gramado de fundo auxotrofio.

A mistura de ativação metabólica (fração S9) preparada a partir dos fígados de ratos Sprague Dawley tratados com a mistura policlorada de bifenila Aroclor 1254 (500 mg/kg) foi adquirida da Molecular Toxicology Inc. (Molecular Toxicology Inc.). (Boone, NC, EUA) e recém-preparado antes de cada teste. O sistema de ativação metabólica consistiu de 4% de fração S9, 1% de cloreto de magnésio 0,4 M, 1% de cloreto de potássio 1,65 M, 0,5% de D-glucose-6-fosfato dissódico 1 M, e 4% de nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato de sódio (NADP) 0.1 M em 50% de tampão fosfato 0,2 M e 39,5% de água destilada estéril.

Após a incubação, foram adicionados 2 mL de ágar superior, e a mistura foi vertida em uma placa contendo o mínimo de ágar. As placas foram incubadas a 37°C durante 48 h, e as colônias reversíveis His+ foram contadas manualmente.

Os resultados foram analisados com o pacote de software estatístico Salanal 1.0 (U.S. Environmental Protection Agency, Monitoring Systems Laboratory, Las Vegas, NV, do Research Triangle Institute, RTP, NC, EUA); o modelo de Bernstein et al. foi adotado. Os dados (revertantes/placa) foram avaliados através da análise de variância (ANOVA), seguida de regressão linear. O índice mutagênico (IM) também foi calculado para cada concentração testada e correspondeu ao número médio de revertentes por placa de teste dividido pelo número médio de revertentes por placa de controle do solvente. Uma amostra foi considerada mutagênica quando uma relação dose-resposta foi detectada e o MI foi maior que duas (MI > 2) em uma ou mais concentrações .

Os seguintes mutagênios padrão foram usados como controles positivos em experimentos sem mistura S9: 4-nitro-O-fenilenodiamina (10 μg/placa) para TA98 e TA97a, azida de sódio (1,25 μg/placa) para TA100, e mitomicina C (0,5 μg/placa) para TA102. Em experimentos com ativação S9, 2-antramina (1,25 μg/placa) foi usada como controle positivo para TA98, TA97a e TA100, e 2-aminofluoreno (10 μg/placa) foi usado como controle positivo para TA102. DMSO serviu como controle solvente (100 μL/placa) e o controle negativo corresponde à taxa de reversão espontânea de cada linhagem.

3. Resultados

Tabela 2 mostra o número médio de revertentes/placa (M), o desvio padrão (DP) e o índice mutagênico (MI) observado para S. Cepas de Typhimurium TA98, TA100, TA102 e TA97a na presença (+S9) ou na ausência (-S9) de ativação metabólica após tratamento da amostra com a oleorresina, extrato ou composto alvo.

Nem os extratos de C. lucens e C. multijuga leaf nem as oleorresinas de C. langsdorffii e C. oblongifolia causaram mutações genéticas, como evidenciado pelo teste de Ames. O ácido Kaurenóico também não aumentou o número de colônias revertentes, portanto não exerceu efeitos mutagênicos em nenhuma das concentrações testadas ou em nenhuma das cepas avaliadas. O controle de solventes (DMSO) não diferiu significativamente do número de revertentes do controle negativo.

4. Discussão

Os efeitos mutagênicos exercidos pelas plantas não são facilmente perceptíveis em humanos, e resultados adversos a longo prazo, como o câncer, podem se manifestar. Assim, a literatura científica tem destacado a importância da triagem de plantas medicinais para a sua potência mutagênica. Neste sentido, examinamos aqui o potencial mutagênico da Copaifera spp. e do ácido kaurenóico com o auxílio do teste Ames. Akyıl e Konuk enfatizaram que a detecção de agentes genotóxicos muitas vezes depende do uso de bactérias como organismos de teste. Desta forma, o teste de Ames (ou teste Salmonella/microssoma) é o método mais comumente usado para detectar efeitos mutagênicos do agente genotóxico .

O desempenho do teste de Ames usando diferentes cepas é de grande importância considerando as peculiaridades de cada uma delas em relação ao teste. Desta forma, o marcador hisG46 na cepa TA100 resulta da substituição de uma leucina (GAG/CTC) por uma prolina (GGGG/CCC). Esta mutação é revertida para o estado de tipo selvagem por mutagênios que causam mutações de substituição de pares de base principalmente em um dos pares GC. A sua mutaçãoD3052 transportada pela estirpe TA98 é uma mutação de -1 framehift que afeta o quadro de leitura de uma sequência repetitiva próxima -C-G-C-G-C-G-C-G-G-. A reversão da mutação hisD3052 de volta ao estado selvagem é induzida por vários agentes mutagénicos de framehift como o 2-nitrofluoreno e vários derivados aromáticos nitroso de aminas carcinogénicas. A mutação hisD6610 na cepa TA97a também carrega uma mutação de +1 frameshift (citosina) resultando numa corrida de 6 citosinas (-C-C-C-C-C-C-C-). Acredita-se que esta estirpe seja mais sensível a alguns dos mutagênios que revertem a estirpe TA98. A estirpe TA102 foi desenvolvida contendo pares de bases AT no local de mutação do hisG428. A mutação é transportada no plasmídeo multicópia pAQ1. O plasmídeo confere resistência à tetraciclina, que é um marcador conveniente para detectar a presença do plasmídeo. A mutação do hisG428 é uma mutação ocre, TAA, no gene hisG, que pode ser revertida por todas as seis possíveis alterações de pares de base; tanto transições como transversais. Esta mutação também é revertida por mutagênios que causam danos oxidativos, além de detectar agentes reticulados .

Além disso, um químico biologicamente ativo pode ser biotransformado em um metabólito inativo. Da mesma forma, uma substância química inativa pode ser biotransformada em um metabólito ativo. Portanto, é importante utilizar a fração S9 no teste Ames: ela permite que as análises sejam realizadas na presença do metabolismo, fornecendo assim resultados mais confiáveis.

A heroína, quanto à segurança, em nossos achados nem o ácido kaurenóico nem as plantas investigadas (extratos e oleorresinas) exerceram efeitos mutagênicos nas diferentes cepas de Salmonella Typhimurium independentemente da ativação da S9.

Maior parte dos trabalhos sobre o gênero Copaifera relatam sobre oleorresinas retiradas do tronco da árvore. No entanto, o estudo de extratos de folhas também é relevante, pois eles contêm moléculas bioativas promissoras. De fato, a busca pela cura de doenças através da infusão de folhas pode ter sido uma das primeiras formas de utilização de produtos naturais, prática que ainda hoje é adotada .

Many Copaifera spp. são popularmente empregadas como plantas medicinais em diferentes países, pois estas espécies apresentam inúmeras propriedades farmacológicas. Quanto ao ácido kaurenóico, vários efeitos biológicos também foram relatados .

Nosso estudo é o primeiro a investigar sobre a segurança das espécies C. lucens e C. oblongifolia e também a empregar C. langsdorffii em oleorresina para o estudo da mutagenicidade. Os efeitos do C. multijuga (oleoresina/extracto) no DNA foram abordados em estudos anteriores, no entanto, empregando diferentes técnicas em relação ao nosso estudo que utilizou o teste de Ames. Assim, nossos resultados corroboram com dados publicados por outros autores, que testaram outras espécies de Copaifera e seus constituintes químicos, ou utilizaram diferentes modelos experimentais, e demonstraram que não danificam o DNA.

Desta forma, a oleorresina de C. multijuga foi utilizada em estudos anteriores, porém empregando diferentes técnicas em relação ao nosso estudo que utilizou o teste de Ames. multijuga e seu marcador químico, ácido diterpeno copálico, foram avaliados por Alves et al. através do ensaio de micronúcleo (célula V79) e do teste Ames para estudo in vitro, assim como os ensaios de micronúcleo e cometa (ratos suíços) para ensaio in vivo. Os dados obtidos mostraram que nenhum deles exerce qualquer efeito genotóxico/mutagênico sob as condições experimentais empregadas. Quando comparados aos nossos resultados, esses dados indicam que para C. multijuga tanto o extrato, que foi avaliado em nosso estudo, quanto a oleorresina, conforme avaliado por Alves et al. , não afetam o número de colônias revertentes em relação ao controle negativo no teste de Ames; o mesmo se aplica ao ácido copálico e ao ácido kaurenóico. Estes achados sugerem que a mutagenicidade está ausente, independentemente da ativação metabólica.

Num estudo recente, Furtado et al. avaliaram o potencial genotóxico da C. multijuga e os resultados demonstraram ausência de danos ao DNA, tendo em vista que o tratamento tanto com oleorresina quanto com o extrato foliar de C. multijuga não aumenta significativamente a freqüência micronúcleo in vitro (célula V79) e in vivo (ratos suíços). Além disso, os autores também avaliaram extratos e oleorresinas de outras espécies deste gênero, como C. duckei, C. reticulata, C. paupera e C. pubiflora e, assim como os resultados encontrados para C. multijuga, foi relatada a ausência de genotoxicidade para todas as espécies testadas.

Os resultados obtidos em estudos de Alves et al. e Batista et al. demonstraram que o extrato de C. langsdorffii não aumentou significativamente a freqüência de micronúcleos (ratos suíços) no sangue periférico e na medula óssea, respectivamente. Em outros estudos, o ensaio do cometa com ratos Wistar não revelou diferenças significativas entre animais tratados apenas com o extrato de C. langsdorffii e o grupo de controle negativo. Estes dados mostram que o extrato não apresenta genotoxicidade.

Recentemente, o teste in vivo do micronúcleo e o ensaio do cometa utilizando ratos Wistar mostraram que o extrato de Copaifera malmei não é genotóxico e tem atividade antimutagênica. Além disso, o teste de toxicidade subcrônica não revelou alterações toxicologicamente relevantes, a julgar pelas análises comportamental, bioquímica e hematológica por até 30 dias. Estes resultados apontaram para a alta margem de segurança do extrato de Copaifera malmei para uso terapêutico. As determinações de toxicidade e genotoxicidade evidenciaram que o uso do óleo de copaíba também é seguro: a avaliação histopatológica não revelou alterações em animais tratados com óleo de copaíba e a avaliação de mutagenicidade (teste micronúcleo; 2000 mg/kg a.w.) não mostrou efeitos genotóxicos .

Leandro et al. usaram o teste Ames para mostrar que o extrato de C. trapezifolia não é mutagênico contra as mesmas cepas de Salmonella Typhimurium aqui testadas, independente da ativação metabólica.

Em relação à composição química das várias espécies de Copaifera, as análises UPLC-MS/MS e CG/MS das oleorresinas identificaram diterpenos ácidos e grandes sesquiterpenos voláteis, enquanto altos teores de compostos fenólicos, incluindo heterósidos flavonóides e derivados de ácido galloilquínico foram verificados nas folhas . Entre os componentes da oleorresina, os diterpenos são de longe os principais componentes e incluem ácido ent-agático, ácido ent-copálico e ácido ent-kaurenóico, seguidos por sesquiterpenos como β-bisaboleno, α-humuleno e trans-β-caryophyllene . No caso da espécie Copaifera, os extratos hidroalcoólicos foliares contêm principalmente quercetina, afzelina e ácidos quínicos .

De acordo com Almeida et al. a oleorresina de copaíba (produto comercial) e suas frações, que contêm sesquiterpenos, ésteres metílicos do ácido carboxílico diterpeno, e altos níveis de β-caryophyllene, não são genotóxicos como evidenciado pelo ensaio in vivo de cometa ou teste de micronúcleo. β-caryophyllene, o principal constituinte das oleorresinas e frações voláteis, não promove efeitos citotóxicos ou genotóxicos em culturas de linfócitos humanos, e protege contra danos de DNA induzidos por sulfonato de metano etílico. A avaliação de nove sesquiterpenos, incluindo o trans-cariófeno, pelo teste Ames mostrou que nenhum dos compostos é mutagênico .

Num estudo recente, o tratamento do câncer gástrico e das linhas celulares normais da mucosa do estômago com ácido kaurenóico mostrou que a concentração de ácido está fortemente correlacionada com o índice de dano ao DNA e com a freqüência do micronúcleo, conforme determinado pelo ensaio do cometa e pelo teste do micronúcleo, respectivamente . Por outro lado, Cavalcanti et al. relataram que baixas concentrações de ácido kaurenóico, um diterpenóide bioativo extraído de C. langsdorffii, também não exerce dano ao DNA ou altera a freqüência do micronúcleo nas células V79. O dano ao DNA significativamente aumentado tornou-se evidente somente após exposição celular a maiores concentrações de ácido kaurenóico (30 ou 60 μg/mL).

Aqui, nós determinamos a toxicidade do ácido kaurenóico para cada cepa avaliada de Salmonella Typhimurium, usando concentrações ácidas a partir do limite de toxicidade. Concentrações mais elevadas de ácido kaurenóico impedem o crescimento bacteriano, o que nos permitiu avaliar o potencial mutagênico deste composto. Com base em nossos resultados, as oleorresinas aqui testadas não são mutagênicas mesmo nas concentrações mais altas do ensaio.

De acordo com a literatura, o uso de diferentes organismos ou diversos sistemas de teste pode fornecer resultados distintos . Isto porque os sistemas de teste de genotoxicidade e mutagenicidade estão divididos em dois grupos. Os métodos citogenéticos analisam os eucariotas e fornecem informações que variam desde a mutação genética até danos cromossômicos e aneuploidias. Em contraste, os métodos bacterianos analisam procariotas e fornecem informações sobre a mutação gênica e danos ao DNA primário causados por um agente .

Assim, testes como troca cromatídeo irmão, aberração cromossômica e micronúcleo foram aplicados para detectar danos ao DNA a nível cromossômico na biomonitorização humana, enquanto o ensaio de mutagenicidade Ames Salmonella/microssoma tem sido extensivamente empregado para verificar a atividade mutagênica de inúmeras substâncias químicas e extratos brutos de plantas.

De acordo com Ferguson , as substâncias podem ser clastogênicas no caso de células de mamíferos, que é o caso das substâncias usadas no teste do micronúcleo. No entanto, essas mesmas substâncias podem dar negativo em ensaios bacterianos, como o teste de Ames. Assim, é importante avaliar a segurança das plantas ou dos seus compostos químicos, focando a avaliação dos diferentes tipos de danos genéticos. A associação do teste Ames com estudos in vitro de células de mamíferos é recomendada porque eles podem cobrir vários parâmetros mutagênicos essenciais (mutações genéticas, danos estruturais cromossômicos e aneuploidia) e também cobrir os testes em sistemas procarióticos e eucarióticos. Além disso, a literatura também destaca que o estudo pelo teste Ames não deve ser omitido porque o teste de mutação de genes bacterianos detecta todos os modos de ação relevantes que levam especificamente a mutações genéticas .

Trabalhos anteriores observaram que os compostos podem ser exclusivamente positivos em uma ou mais linhas celulares de mamíferos, ou seja, os resultados positivos não foram apoiados pelo teste Ames ou testes in vivo . Na verdade, os resultados obtidos primeiro pelo teste Ames são posteriormente reproduzidos em testes com animais; portanto, a ausência de mutagenicidade no teste Ames permitiu que novos medicamentos com menos efeitos colaterais fossem produzidos . Estes dados destacam a importância de estudos como o nosso, demonstrando a ausência de mutagenicidade vegetal e seus principais componentes, usando o teste de Ames.

5. Conclusões

Overall, nossos resultados apóiam o uso seguro das plantas medicinais selecionadas pertencentes ao gênero Copaifera. No entanto, os efeitos mutagênicos de compostos únicos podem ser mascarados devido aos efeitos antagônicos de outros compostos presentes em extratos ou oleorresinas . Assim, nossos resultados também demonstram que tanto o ácido kaurenóico quanto as plantas medicinais avaliadas podem ser considerados potencialmente seguros para uso terapêutico.

Dados Disponibilidade

Os dados utilizados para apoiar os resultados deste estudo estão incluídos no artigo.

Disclosure

Carlos Henrique Gomes Martins, Flávia Aparecida Resende e Jaqueline Lopes Damasceno tiveram pleno acesso a todos os dados do estudo e assumem a responsabilidade pela integridade dos dados e pela exatidão da análise dos dados.

Conflitos de interesse

Os autores não têm conflitos de interesse a divulgar.

Contribuições dos autores

Yadira Fernández Arnet, Giovanna Capaldi Fortunato, Luiza Girotto, Gabriel Davi Marena, Beatriz Patti Rocha, Flávia Aparecida Resende, Sergio Ricardo Ambrosio, Rodrigo Cássio Sola Veneziani, e Jairo Kenupp Bastos fizeram contribuições substanciais para a concepção e desenho, aquisição, análise e interpretação dos dados. Jaqueline Lopes Damasceno, Flávia Aparecida Resende e Carlos Henrique Gomes Martins estiveram envolvidos na redação do manuscrito ou na revisão crítica do mesmo, por seu importante conteúdo intelectual. Carlos Henrique Gomes Martins e Flávia Aparecida Resende concordaram em ser responsáveis por todos os aspectos do trabalho. Todos os autores leram e aprovaram o manuscrito final.

Agradecimentos

Os autores agradecem à CAPES (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior), ao CNPq (Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico) e à Fundação de Pesquisa de São Paulo (FAPESP, Subsídios nos. 2011/13630-7 e 2012/25237-0) pelo apoio financeiro e à Universidade de Franca pelo apoio recebido. Jaqueline Lopes Damasceno recebeu uma bolsa de doutorado CAPES (Coordination for the Improvement of Higher Level-or Education-Personnel).