Protrombina desempenha um papel fundamental na coagulação do sangue (Fig. 1, 2). Suas propriedades funcionais estão relacionadas à presença de resíduos gama-carboxi-glutamil (Gla), que resultam da carboxilação pós-tradução dependente de vitamina K de dez resíduos específicos de glutamil (Fig. 3,4). Meus estudos bovinos (por exemplo, examinando a ligação entre ligação metal-ion e função protéica dentro do complexo “”””””””protrombinase””””””””) irão diferenciar entre liganding e os subseqüentes envolvimentos conformacionais dos resíduos de Gla no processo fisiológico normal. Dentro desta estrutura, eu isolei e caracterizei previamente seis diferentes variantes de protrombina Gla-deficiente (0-,1-,2-,3-,5- e 7-Gla). Cada uma gerou trombina quantitativamente, mas a uma taxa nitidamente mais lenta (K/m elevado) do que a protrombina de 10-Gla devido à diminuição acentuada da ligação Ca/2+- e fosfolípidos em relação à protrombina normal de 10-Gla. As variantes de 7 e menos gla revelam apenas 3% da atividade normal da protrombina, quando medidas por suas habilidades de acelerar a coagulação da protrombina e do plasma deficiente em fator VII. As protrombinas 8 e 9-Gla recentemente isoladas possuem, respectivamente, 18 e 75% da atividade normal, proporcionando uma transição entre as protrombinas de 7 e 10-Gla. O isolamento das variantes de 8 e 9-Gla tornou-se possível através da utilização de anticorpos monoclonais (McAb) contra a estrutura estabilizada de Ca2+ (Ca II Ab) da protrombina para cromatografia de imunoafinidade. Meus estudos imunoquímicos com Ca II Ab, policlonal e monoclonal, mostraram que eles (policlonal) não são específicos para protrombina normal, pois reagem de forma cruzada com variantes 7, 8 e (particularmente) 9-Gla. Além disso, meus dados preliminares com protrombinas 5 e 7-Gla sugerem que as posições 15 e 17 de Glu não são modificadas, e as posições seletivas (resíduos 7,8,20,30,33) podem ser preferencialmente carboxiladas. A pesquisa proposta irá revelar se as protrombinas Gla- deficiente são de fato seletivamente deficientes, indicando a ordem de “”””””””in vivo”””””””” carboxilação dos resíduos de Glu. Minha experiência em descrever como a posição e/ou número de resíduos de Gla afetam as propriedades funcionais, físico-químicas (conformacionais) e imunoquímicas da protrombina e do Fragmento 1 contendo Gla formam a base para o isolamento de materiais humanos tanto para estudos básicos como clínicos. Isolarei protrombinas normais e as mais cruciais protrombinas Gla-deficientes. Estas últimas serão então divididas em dois (ou mais) grupos de acordo com a sua actividade fisiológica. O objetivo será monitorar o plasma dos pacientes em terapia com warfarina para protrombinas normais, 9-Gla (se esta for a única que é funcionalmente ativa e total (normal mais Gla-deficiente) por imunoensaios com anticorpos monoclonais específicos para avaliar o estado hemostático desses pacientes.
O objectivo é determinar porque alguns doentes exibem episódios trombóticos enquanto outros permanecem mais propensos a hemorragia, apesar da sua bioactividade protrombínica plasmática ser mantida a níveis clinicamente aceitáveis. Além disso, as protrombinas Gla-deficientes podem fornecer outro marcador para disfunção hepática.