Efeitos do modafinil no comportamento e nos parâmetros de danos oxidativos no cérebro de ratos Wistar
Abstract
Foram avaliados os efeitos do modafinil (MD) nos danos comportamentais e oxidativos a proteínas e lipídios no cérebro de ratos. Os ratos Wistar receberam uma única administração por gavagem de água ou MD (75, 150, ou 300 mg/kg). Os parâmetros comportamentais foram avaliados em aparelhos de campo aberto 1, 2, e 3 h após a administração de drogas. As substâncias reativas ao ácido tiobarbitúrico (TBARS) e a formação de proteína carbonila foram medidas no cérebro. MD aumentou a atividade locomotora na dose mais alta 1 e 3 h após a administração da droga. A administração de MD na dose de 300 mg/kg aumentou as visitas ao centro de campo aberto 1 h após a administração; no entanto, 3 h após a administração, todas as doses administradas de MD aumentaram as visitas ao centro de campo aberto. MD 300 mg/kg aumentou os danos lipídicos na amígdala, hipocampo, e estriato. Além disso, o MD aumentou os danos proteicos no córtex pré-frontal, amígdala e hipocampo; contudo, este efeito varia de acordo com a dose administrada. Em contraste, a administração de MD 75 e 300 mg/kg diminuiu o dano protéico no estriato. Este estudo demonstrou que a administração do MD induz alterações comportamentais, o que dependia da dose utilizada. Além disso, os efeitos do MD nos parâmetros de dano oxidativo pareciam estar na região e doses específicas do cérebro.
1. Introdução
Modafinil (MD) é uma droga psicoativa não anfetamínica frequentemente prescrita para o tratamento do sono, como narcolepsia, síndrome da apneia obstrutiva do sono e distúrbio do sono do trabalho por turnos. Além disso, é bem descrito na literatura que o MD melhora a função em vários domínios cognitivos, bem como a memória de trabalho e a memória episódica. Estes efeitos da MD na memória também têm sido descritos em pacientes psiquiátricos, sugerindo que este medicamento é um excelente agente candidato para o tratamento da disfunção cognitiva em distúrbios psiquiátricos . Além disso, pesquisas clínicas têm mostrado que o MD melhora os sintomas em pacientes com depressão grave, distúrbio bipolar, esquizofrenia e distúrbio de déficit de atenção/hiperactividade (TDAH) .
O mecanismo de acção do MD é mal compreendido; no entanto, sabe-se que este medicamento tem um efeito importante nas catecolaminas, serotonina, glutamato, ácido gama-amino-butírico, orexina e sistemas histamínicos no cérebro . Além disso, estudos mostram que o MD inibe o transportador de dopamina, aumentando a neurotransmissão dopaminérgica nos circuitos de vigilância. Psicoestimulantes como anfetaminas, que também atuam em vários sistemas neurotransmissores, demonstraram ter um efeito pronunciado no comportamento, incluindo a geração de medo, ansiedade e hiperatividade . Entretanto, o MD está menos relacionado a efeitos colaterais, tais como hiperatividade, ansiedade, nervosismo ou efeitos de ricochete do que os estimulantes tradicionais .
Estudos transversais sugeriram que a administração de psicoestimulantes pode levar a estresse oxidativo no cérebro de ratos. O cérebro é particularmente vulnerável à produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) porque metaboliza 20% do oxigênio total do corpo e tem uma quantidade limitada de capacidade antioxidante. A administração crônica de psicoestimulantes como metilfenidato, m-anfetamina e d-anfetamina em ratos induziu aumento da produção de superóxido, danos oxidativos às proteínas, lipídios e DNA, e alterações nas enzimas antioxidantes e nos complexos da cadeia respiratória mitocondrial.
Por isso, o objetivo do presente estudo foi avaliar o efeito do MD no comportamento e parâmetros de estresse oxidativo no hipocampo, córtex pré-frontal, amígdala e estriato de ratos.
2. Métodos experimentais
2.1. Animais
Os sujeitos foram ratos Wistar machos adultos (pesando 250-350 g) obtidos de nossa colônia reprodutora. Os animais foram alojados como cinco em uma gaiola com comida e água disponíveis ad libitum e foram mantidos em um ciclo de 12 h de luz/escuro (luzes acesas às 7:00 a.m.) a uma temperatura de °C. Todos os procedimentos experimentais foram realizados de acordo com a aprovação do Comitê de Ética local no uso de animais na Universidade do Extremo Sul Catarinense. Todos os experimentos foram realizados ao mesmo tempo durante o dia para evitar variações circadianas.
2,2. Medicamentos e Procedimentos Farmacológicos
O MD (Libbs Farmacêutica Ltda) foi suspenso no veículo-veículo: 1% de metilcelulose na água. As soluções foram preparadas imediatamente antes do uso e foram protegidas da luz durante a sessão experimental. A solução suspensa esteve sob agitação durante todo o período de injeção. O grupo controle recebeu o veículo.
2,3. Desenho Experimental
O número total de ratos utilizados neste experimento foi de 40 (animais por grupo). Os animais receberam uma dose única de MD (75, 100, ou 300 mg/kg de peso corporal) em um volume de 1 mL/kg, administrado por gavagem. O grupo de controle recebeu veículo em um volume de 1 mL/kg. A atividade locomotora foi medida 1, 2, e 3 h após a injeção, e os ratos foram mortos por decapitação logo após a tarefa de campo aberto.
2,4. A atividade locomotora
Atividade locomotora foi avaliada usando a tarefa de campo aberto, como descrito anteriormente . Esta tarefa foi realizada em um campo aberto de 40 × 60 cm rodeado por paredes de 50 cm de altura, feitas de compensado marrom, com o piso sendo dividido em 9 quadrados iguais por linhas pretas. Os animais foram suavemente colocados no rectângulo traseiro esquerdo e deixados livres para explorar a arena durante 5 minutos. No teste de campo aberto, foram avaliados os seguintes parâmetros comportamentais.
Crossings (atividade locomotora/atividade horizontal): o número total de quadrados cruzados por ratos em todo o período do teste foi contado.
Rearings (atividade exploratória/atividade vertical): a postura erecta total de ratos em todo o período do teste foi contada.
Visitas ao centro do campo aberto: o número total de visitas ao centro do campo aberto foi contado. Um quadrado central de cm foi definido como a área do “centro” do campo.
2,5. Medição dos marcadores de danos oxidativos
Ratos foram tratados com MD ou água como descrito acima e foram mortos por decapitação 3 h após a última injeção e seus cérebros foram removidos e dissecados para avaliação dos níveis de danos oxidativos no córtex pré-frontal, amígdala, hipocampo e estriato. As formações de TBARS e proteínas carbonila foram medidas conforme descrito anteriormente .
2,6. Thiobarbituric Acid Reactive Substances (TBARS)
A formação de TBARS durante uma reação de aquecimento ácido foi medida como um índice de produção de ROS, que é amplamente adotado como um método sensível para a medição da peroxidação lipídica, como descrito anteriormente . Em resumo, as amostras foram misturadas com 1 mL de ácido tricloroacético 10% (TCA) e 1 mL de ácido tiobarbitúrico 0,67% (TBA) e depois aquecidas em um banho de água fervente por 15 min. Os TBARS foram determinados pela absorvância a 535 nm. Os resultados são expressos como equivalentes de MDA (malondialdeído) (nmol/mg de proteína).
2,7. Mensuração dos Carbonilos Proteicos
O dano oxidativo às proteínas foi avaliado pela determinação dos grupos carbonilo com base na reação com dinitrofenilidrazina (DNPH), como descrito anteriormente . Em resumo, as proteínas foram precipitadas pela adição de 20% de ácido tricloroacético e redissolvidas em DNPH e a absorvância lida a 370 nm.
2,8. Análise estatística
Todas as análises foram realizadas com o pacote estatístico para ciências sociais versão 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, EUA). Todos os dados são apresentados como média ± SEM. As diferenças entre os grupos na análise comportamental foram verificadas através da análise de medidas repetidas de variância para acessar a curva de resposta temporal, seguida pelos testes pós-hoc de Tukey. Para testar as diferenças entre os grupos na análise bioquímica, utilizou-se ANOVA, seguida pelos testes pós-hoc de Tukey. Em todos os experimentos, os valores < 0,05 foram considerados para indicar significância estatística.
3. Resultados
3,1. Análise comportamental
Para a análise de locomoção (travessias) (Figura 1(a)), a análise de medidas repetidas de variância revelou diferenças significativas para a administração MD (F(3,35) = 7,91, ) e para as repetições comportamentais (F(2,7) = 54,82, ). Análise adicional com o teste pós-hoc de Tukey mostrou que o MD em 300 mg/kg aumentou a locomoção espontânea do rato em relação ao grupo controle 1 h após a administração. Além disso, o grupo controle, MD em 75 mg/kg, e MD em 150 mg/kg apresentaram redução do número de cruzamentos quando reexpostos 3 h depois para o campo aberto, indicando assim habituação ao ambiente. Contudo, o MD a 300 mg/kg de ratos tratados mostrou um número reduzido de travessias quando reexpostos 2 e 3 h mais tarde para o campo aberto. Esta diferença pode ser explicada pela hiperactividade motora induzida 1 h após a administração do MD na dose de 300 mg/kg.
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Para a análise de exploração (crias) (Figura 1(b)), a análise de medidas repetidas de variância revelou diferenças significativas para as repetições comportamentais (F(2,7) = 32,7, ). Análises posteriores com o teste pós-hoc de Tukey mostraram que o grupo controle, MD em 75 mg/kg, e MD em 150 mg/kg mostraram um número reduzido de recriações quando reexpostos 3 h mais tarde para o campo aberto. O MD em 300 mg/kg diminuiu o número de recriações quando reexpostos 2 e 3 h mais tarde para o campo aberto.
Para a análise de visitas ao centro do campo aberto (Figura 1(c)), a análise de medidas repetidas de variância revelou diferenças significativas para a administração do MD (F(3.34) = 15.70, ). Uma análise adicional com o teste pós-hoc de Tukey mostrou que o MD a 300 mg/kg aumentou as visitas ao centro de campo aberto em comparação com o controle 1 h após a administração. Além disso, o MD em todas as doses administradas aumentou as visitas ao centro de campo aberto 3 h após a administração.
3,2. Análise Bioquímica
Como mostrado na Figura 2(a), os níveis de TBARS foram significativamente aumentados na amígdala (F(3) = 4,18, ), hipocampo (F(3) = 44,9, ), e estriato (F(3) = 7,07, ) de ratos tratados com MD a 300 mg/kg, em comparação com o grupo controle.
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Como pode ser observado na Figura 2(b), um aumento significativo na geração de carbonila foi detectado após a administração do MD no córtex pré-frontal (F(3) = 29,9, ) na dose de 300 mg/kg e na amígdala (F(3) = 9,74, ) e hipocampo (F(3) = 17,99, ) na dose de 75 mg/kg. Por outro lado, o tratamento com MD na dose de 75 e 300 mg/kg reduziu significativamente a geração de carbonila no estriato (F(3) = 21,93, ) em relação ao grupo controle.
4. Discussão
No presente estudo, observamos que uma única injeção de MD em dose alta (300 mg/kg) induz hiperlocomotion em ratos, que não permanece 2 e 3 horas após a administração. De acordo com nossos resultados, a MD aumentou significativamente a atividade locomotora e aumentou os níveis de dopamina extracelular striatal em macacos rhesus . Jovens e colegas mostraram que a MD aumentou a atividade, a criação e a suavidade das vias locomotoras em camundongos C57BL/6J e 129/SJ. Essas alterações de comportamento induzidas pela MD estavam relacionadas ao aumento da dopamina sináptica e às ações secundárias mediadas pelos receptores dopaminérgicos drd1 e drd4. Ao contrário do estudo acima, embora haja uma tendência, não observamos um aumento significativo no comportamento exploratório após a administração do MD. Esta discrepância pode ser explicada por diferenças na metodologia, espécies e tempo de tratamento.
Aqui, observamos que o grupo controle e o MD em baixas doses (75 e 150 mg/kg) reduziram o número de cruzamentos e recriações quando reexpostos 3 horas mais tarde para o campo aberto, indicando habituação ao ambiente. O MD na dose alta (300 mg/kg) reduziu o número de cruzamentos e recriações quando reexpostos 2 e 3 horas mais tarde ao campo aberto. Esta discrepância pode ser explicada pelo fato de que 1 h após a administração do MD (300 mg/kg) aumentou significativamente o número de cruzamentos e uma tendência para aumentar o número de recriações. Acredita-se que a habituação a um novo ambiente é uma das formas mais elementares de aprendizagem não-associativa. A exposição repetida ao mesmo ambiente induz uma redução no comportamento exploratório, que pode ser tomado como um índice de habituação .
Uma descoberta interessante do estudo atual foi que o MD modulou o comportamento relacionado à ansiedade. No teste de campo aberto, os ratos tratados com MD estavam menos ansiosos e até tenderam a explorar a área central aversiva mais do que os controles. O MD a 300 mg/kg aumentou o número de visitas ao centro do campo aberto 1 h após a administração. Além disso, o MD em todas as doses administradas aumentou o número de visitas ao centro do campo aberto 3 h após a administração. Na literatura, os estudos são controversos sobre o efeito do MD na ansiedade. Estudos pré-clínicos não demonstraram efeitos do modafinil sobre a ansiedade ou um efeito ansiolítico. Da mesma forma, o MD nos estudos clínicos mostra ou um efeito ansiolítico ou nenhum efeito sobre a ansiedade , enquanto outros demonstram um efeito ansiogênico . Esta diferença entre estudos pode ser explicada pela variação nas doses utilizadas (100 mg, 200 mg, ou 400 mg) e na programação de dosagem (uma vez em relação à dosagem crônica durante uma semana ou mais). Os efeitos ansiolíticos do MD podem ser explicados pelos seus efeitos sobre a amígdala, que é uma região do cérebro implicada na ansiedade, para os estímulos ameaçadores. Um estudo anterior mostrou que o MD diminui a reatividade da amígdala a estímulos temerosos. Sabe-se que a amígdala é rica em projeções catecolaminérgicas e serotoninérgicas , e então provavelmente a MD reduz a reatividade da amígdala por alterações na sinalização intra-amígdala resultantes de alterações nos sistemas de noradrenalina, dopamina, serotonina ou GABA ou de uma combinação desses efeitos.
Além de induzir alterações comportamentais, está bem descrito na literatura que os psicoestimulantes causam danos oxidativos tanto em modelos animais quanto em humanos . Nossos resultados mostram que o MD aumenta os danos oxidativos aos lipídios e proteínas no cérebro de ratos. Os níveis de TBARS foram aumentados na amígdala, hipocampo e estriato de ratos tratados com MD em dose alta (300 mg/kg). Além disso, observamos um aumento na geração de carbonila após a administração do MD no córtex pré-frontal na dose de 300 mg/kg e na amígdala e hipocampo na dose de 75 mg/kg. Estudos mostram que o MD inibe o transportador de dopamina, aumentando a neurotransmissão dopaminérgica. O aumento na concentração extracelular de dopamina induzido pelo MD pode induzir a superprodução do metabolito tóxico da oxidação da dopamina , levando a danos oxidativos às proteínas e lipídios no cérebro de ratos. Na literatura, não há estudos avaliando o dano cerebral após a administração do MD; entretanto, esses estudos são muito importantes, uma vez que a acessibilidade do MD, como alertas, memorização e medicamento anti-fadiga, para pessoas saudáveis está aumentando .
Conversamente, o tratamento com MD (75 e 300 mg/kg) reduziu a geração de carbonila no estriato em comparação com o grupo controle. Alguns estudos têm demonstrado o potencial neuroprotetor do MD para o striatal. Estudos anteriores mostraram melhora da sobrevida de 1-metil-1,2,3,6-tetrahidropiridina intoxicada por neurônios dopaminérgicos no striatum após o tratamento com MD, em modelo animal da doença de Parkinson. Raineri e colegas mostraram que a administração de MD atenuou a neurotoxicidade induzida por metanfetaminas no estriato de ratos, sugerindo um possível papel protetor do MD nesta região cerebral. A MD mostrou melhorar a aprendizagem em pacientes dependentes de metanfetaminas . Os resultados aqui apresentados sugerem que a administração de MD pode exibir propriedades antioxidantes no estriato; contudo, o efeito protetor do MD no estriato ainda é desconhecido. O estriato integra insumos glutamátricos do córtex e tálamo com aferentes dopaminérgicos do cérebro médio. A sinalização dopaminérgica desempenha um papel preeminente na aprendizagem dependente do estriato e na plasticidade sináptica dos neurônios de projeção média espinhosa. Rossato e colegas mostraram que a infusão do agonista receptor D1 aumentou os níveis de fator neurotrófico derivado do cérebro (BDNF) e consequentemente a plasticidade sináptica. Assim, o MD pode estar promovendo plasticidade sináptica ativando o sistema dopaminérgico e conseqüentemente protegendo o estriato contra danos oxidativos.
Em conclusão, somos capazes de demonstrar que (1) o MD induz hiperatividade em dose alta (300 mg/kg) 1 h após a administração, que não permanece 2 e 3 horas após a administração. (2) O MD mostrou efeitos ansiolíticos em ratos, aumentando o número de visitas ao centro do campo aberto. (3) O MD induziu danos oxidativos a lipídios e proteínas no cérebro de ratos; entretanto, os danos oxidativos dependem da região cerebral analisada e da dose de MD administrada. (4) Finalmente, o MD poderia proteger o estriato contra o dano oxidativo protéico. Deve-se ter cautela ao interpretar os resultados. Primeiro, as defesas antioxidantes não foram medidas; como este é o primeiro estudo a examinar o impacto do MD no estresse oxidativo, reconhecemos que ele poderia ter ajudado na interpretação dos resultados. Entretanto, segundo, o MD foi administrado a ratos saudáveis; os efeitos do MD no dano oxidativo em modelos animais de doença mental podem mostrar resultados diferentes.
Conflito de Interesses
Os autores declaram que não há conflito de interesses em relação à publicação deste trabalho.
Confirmações
Laboratório de Neurociências (Brasil) é um dos centros do Instituto Nacional de Medicina Translacional (INCT-TM) e um dos membros do Centro de Excelência em Neurociências Aplicadas de Santa Catarina (NENASC). Esta pesquisa foi apoiada por subsídios do CNPq, FAPESC, Instituto Cérebro e Mente, e UNESC. João Quevedo é bolsista do CNPq e Roger B. Varela, Wilson R. Resende e Amanda V. Steckert são bolsistas da CAPES; Samira S. Valvassori é bolsista do CNPq.