Os cromossomos sexuais de mamíferos têm papéis especializados no desenvolvimento de células germinativas masculinas (XY) e femininas (XX) (1). As anormalidades cromossômicas sexuais são a causa genética mais comum da infertilidade humana (2). Na síndrome de Klinefelter (XXY) e do duplo Y (XYY), a espermatogênese é interrompida pelo excesso dos genes X e Y, respectivamente (2). Os homens XYY são geralmente férteis devido à perda espontânea do cromossoma sexual extra (mosaicismo). Em homens XXY, o mosaicismo é menos comum. A recuperação de esperma testicular permitiu a reprodução de alguns homens jovens de Klinefelter, mas tem menos sucesso em pacientes mais velhos (3, 4). Os indivíduos XXY e XYY sem células germinativas XY são inférteis.

Para estudar a infertilidade da TCT, geramos ratos adultos XXY e XYY portadores dos transgenes Blimp1-mVenus (BV) e Stella-ECFP (SC) (5) para monitorar a diferenciação das células-tronco pluripotentes em células germinativas primordiais (PGCLCs) (6). Os XXY machos foram criados pelo acasalamento de uma fêmea do tipo selvagem com um macho variante cromossômica sexual que produz esperma contendo XY (fig. S1). A geração de ratos XYY requer a herança de um cromossoma Y de ambos os pais. Por isso, usamos um cromossoma Y do tipo selvagem paternalmente herdado e um cromossoma Yd1 herdado maternalmente que não expressa o Sry testi-determinante (fig. S1) (7). Como mostrado anteriormente (8, 9), o fenótipo da espermatogênese em ambos os modelos recapitulou que em homens de CST, com parada na fase prospermatogonial em camundongos XXY e no paquidema em camundongos XYY (fig. S2). A espermatogênese foi normal em irmãos transgênicos da euploid XY BVSC.

Nexterior, estabelecemos fibroblastos da TCS e controlamos ratos XY e XX (Fig. 1A). A hibridação in situ da fluorescência de DNA (DNA-FISH) para os genes Slx e Sly do X e Y confirmou que a passagem 4 (P4) da SCT e dos fibroblastos de controle reteve seus complementos cromossômicos sexuais originais (Fig. 1B e fig. S3A). Os fibroblastos foram reprogramados para células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs) (10) de forma induzível por doxiciclina (Dox). O DNA-FISH foi realizado em iPSCs P2 resultantes (Fig. 1A).

Uma alta proporção de linhas iPSC derivadas de TCS exibiu perda cromossômica sexual. De ratos XXY, observamos XY, XX, e XO iPSCs (Fig. 1, C e E). A incidência de perda foi semelhante para os cromossomos X e Y (P = 0,062, teste de Mann-Whitney). A partir dos ratos XYY, observamos XY e XO iPSCs (Fig. 1, D e E). A perda cromossômica Y em homens XYY ocorreu em uma freqüência similar à observada para os cromossomos X e Y combinados em homens XXY (P = 0,089, teste de Mann-Whitney). Comparamos então a incidência de perda de cromossomos sexuais entre TCS derivadas e eupoplóides XY e XX. A perda cromossômica sexual foi mais comum em TCS do que em iPSCs derivados da euróide (Fig. 1E), independentemente do corte usado para definir a perda cromossômica sexual (Fig. S12D).

Perda cromossômica sexual poderia ocorrer durante a reprogramação de células de TCS ou durante a propagação de iPSC para P2, talvez conferindo uma vantagem proliferativa às células euróides resultantes. De fato, a instabilidade cromossômica sexual tem sido observada em células-tronco pluripotentes (11, 12). Para testar esta última hipótese, analisamos a estabilidade cromossômica sexual entre P2 e P6 em iPSCs com complementos altamente parentais (>90%) (fig. S4A). Observamos perda cromossômica sexual nas linhas iPSC XX e XXY (P < 0,01 e 0,05, respectivamente; teste de Wilcoxon com classificação assinada), mas não nas linhas iPSC XY e XYY (P = 0,21 e 0,66, respectivamente; teste de Wilcoxon com classificação assinada). No entanto, nenhuma linha iPSC mostrou uma diminuição superior a 15% no complemento parental (fig. S4B). Além disso, a perda cromossômica sexual entre P2 e P6 não foi tendenciosa para trissomia (fig. S4B). Os iPSCs XY derivados de TCS também não apresentaram vantagem proliferativa sobre os iPSC XXY ou XYY (fig. S5). Como os fibroblastos da TCS também eram cariotipicamente estáveis (fig. 1B e fig. S3A), a perda cromossômica é provavelmente induzida durante a reprogramação do iPSC e, portanto, é distinta da instabilidade cromossômica sexual em células-tronco pluripotentes (11, 12). Referimo-nos ao fenômeno como perda cromossômica tendenciosa por trissomia (TCL).

A seguir determinamos se os iPSC XY euploid derivados de fibroblastos de TCS formariam espermatozóides funcionais. Selecionamos iPSCs P6 altamente euploid (≥80% das células XY) adaptados ao meio livre de Dox (fig. S6). Para nossos experimentos XYY, apenas linhas XY iPSC que mantiveram o tipo selvagem Y em vez do cromossomo Yd1 foram usadas para experimentos PGCLC (fig. S7). Karyotyping confirmou que todas as linhas XY iPSC derivadas de SCT e uma linha XY iPSC de controle eram euploid (fig. S8). Estas linhas iPSC foram diferenciadas (6) através de um estado epiblast-like para criar agregados PGCLC positivos para BV e SC (Fig. 2A). Os PGCLCs BV-positivos (tabela S1) foram isolados por meio de classificação celular ativada por fluorescência (FACS) (Fig. 2B) e transplantados para testes W/Wv (Kit mutante) deficientes em células germinativas (13).

Spermatogênese em receptores foi avaliada 9 a 10 semanas após o transplante. Os teratomas, que são observados após o transplante de PGCLC derivado de iPSC (6), estiveram presentes em 29% das linhas transplantadas XXY e 50% das linhas transplantadas XYY (fig. S9). Reconstituição da espermatogênese, revelada pela presença de colônias espermatogênicas (Fig. 2C) e pela histologia (Fig. 2D), foi observada em todas as linhas iPSC derivadas XXY e XYY utilizadas (Tabela 1). Assim, os iPSC XY derivados de TCS podem diferenciar células germinativas in vitro e espermatogênese completa após o transplante.

Perguntamos se os espermatozóides criados através de transplante poderiam suportar a reprodução. A injeção intracitoplasmática de esperma (ICSI) utilizando esperma de duas linhas iPSC XXY e duas linhas iPSC XY derivadas de XYY (Fig. 2E e fig. S10A) gerou zigotos que se desenvolveram em embriões de duas células in vitro (eficiência 76.7 a 87,3%) (Fig. 2F, fig. S10B e tabela S2) e descendentes normais quando transplantados em receptores (eficiência 46,9 a 59,4%) (Fig. 2G, fig. S10C e tabela S2). A genotipagem da reação em cadeia da polimerase confirmou que os descendentes foram derivados dos PGCLCs transplantados (fig. S10D). Cachorros das linhas iPSC XXY e XYY derivadas mostraram crescimento comparável aos derivados de iPSC XY de controle (fig. S10E). Notavelmente, os filhotes derivados de XXY e XYY tinham complementos euploid (XY ou XX) (fig. S11). Três machos maduros e três fêmeas de cada linha iPSC derivada de XXY e XYY foram cruzados entre si, e todos foram férteis (fig. 2H e fig. S10F). Assim, os espermatozóides dos iPSC XY derivados de TCS dão origem a descendentes cromossomicamente normais, saudáveis e férteis.

Tratamos se a TCL é específica para trissomia dos cromossomos sexuais. Como modelos de camundongos com trissomia para um autossoma completo não estão disponíveis (14), repetimos nossas experiências em camundongos trans cromossômicos Tc1 masculinos, um modelo da síndrome de Down com um cromossomo humano acessório 21 (hChr.21) (15). Ratos Tc1 carregam um cassete de resistência à neomicina hChr.21, seleção para a qual reduz o mosaicismo hChr.21 (15). Portanto, primeiro enriquecemos os fibroblastos Tc1 adultos para a presença de hChr.21 usando o análogo de neomicina G418 (Fig. 3A). O DNA-FISH mostrou que a grande maioria (≥96%) dos fibroblastos Tc1 reteve hChr.21 (Fig. 3B e fig. S3B). Estes fibroblastos Tc1 foram reprogramados sem seleção de G418, e os iPSCs resultantes foram analisados em P2. Dez das 16 linhas iPSC que foram geradas (62,5%) apresentaram perda de hChr.21 em ≥10% das células (Fig. 3, C e D, e fig. S12D). Em contraste, após a remoção de G418, hChr21 foi retido em fibroblastos Tc1 cultivados pelo mesmo período utilizado para reprogramação iPSC (18 dias) e em linhas iPSC P6 que tiveram complementos altamente parentais (>90% hChr.21 positivo) em P2 (Fig. S12, A e B). Concluímos que a perda de hChr.21 em células Tc1 é promovida pela reprogramação em vez da remoção de G418 e, portanto, que TCL também afeta um cromossomo acessório.

Perguntamos a seguir se o TCL ocorre em células humanas. Instâncias de perda cromossômica foram observadas durante a cultura de células trissômicas humanas (16, 17), mas sua prevalência e relação com a reprogramação não tem sido sistematicamente analisada. Selecionamos síndrome de Klinefelter humana, síndrome de Down e linhas de fibroblasto euploide XY e XX exibindo um mosaicismo mínimo (fig. S13, A e D), reprogramamos e determinamos os complementos cromossômicos das linhas iPSC resultantes. Observamos XY e XX iPSCs de fibroblastos da síndrome de Klinefelter e iPSCs euploides de fibroblastos da síndrome de Down (fig. S13, B, C, F, e G). A perda cromossômica foi mais comum em células trissômicas do que em células disômicas, demonstrando que a LTC também ocorre durante a reprogramação humana. Entretanto, a frequência de linhas iPSC altamente európicas foi menor do que aquela observada em iPSC de camundongos derivados de trissomia (fig. S13, F a H).

Demostrou que TCL produz iPSC európicos a partir de TCS e autossomosomos de camundongos e pacientes (fig. S12E). Em camundongos, os iPSCs “corrigidos” resultantes podem formar espermatozóides funcionais, permitindo a produção de descendentes de eupoplóides cromossômicos a partir de indivíduos de TCS inférteis. TCL complementa as terapias iPSC existentes para anormalidades cromossômicas (17-21). Os mecanismos que causam a TCL são desconhecidos. As tensões celulares associadas à reprogramação podem ser selecionadas contra células trissômicas, permitindo o surgimento de células euróides. Observamos TCL menos frequentes em células humanas do que em células de camundongos (figs. S12D e S13H). Mesmo que raro, o TCL poderia oferecer tratamentos para pacientes com TCS inférteis para os quais as abordagens alternativas não são bem sucedidas. Entretanto, o uso clínico de células germinativas humanas feitas in vitro deve ser cuidadosamente considerado de forma ética e legal (22-24). Além disso, a espermatogênese completa in vitro terá que ser desenvolvida para evitar o risco de formação de teratoma através do transplante de células germinativas.

TCL também permite a produção de iPSCs femininas a partir de homens, oferecendo potencial para a dissecção genética de dimorfismos sexuais (25). Ao criar linhas isogênicas iPSC que diferem apenas em relação aos seus cromossomos sexuais, as diferenças sexuais identificadas durante a modelagem da doença iPSC poderiam ser atribuídas aos efeitos cromossômicos X ou Y.