Reagentes de cultura celular

Um estoque de glicerol do Akt1 ORF humano foi obtido como vetor pENTR221 do GE Dharmacon (Human Akt1 ORF Clone ID 100067600). O vetor de destino modificado (pcDNA/FRT/TO), contendo SH Tag, foi um generoso presente do Dr. Matthias Gstaiger (Institute of Molecular Systems Biology, ETH Zurich, Zurique, Suíça). Foram obtidas células Flp-In TREx HEK293 (#R780-07), mistura de enzimas LR Clonase II (#11791-100), vector pOG44 (#V6005-20), Zeocin (#46-0509), Blasticidin S (#R210-01), Hygromycin B (#10687-010), Tet (#550205) e proteína A Dynabeads (#100.02D) da Invitrogen. A Xtremegene 9 (#06365787001) foi adquirida da Roche. DMEM (#12430-054) e RPMI 1640 (#22400-089) foram obtidos da GIBCO. Trypsin (#CC5027.010L) foi adquirido da Genetics. FBS normal (#SH30070.03) bem como FBS com tela Tet (#SH30070.03T) foram adquiridos da Hyclone. Aphidicolin (#A0781-10MG), Nocodazole (#M1404-10MG), Propidium Iodide (#P4170-250 mg) e Lys C protease (#P3428) foram obtidos da Sigma. Os rótulos SILAC foram obtidos dos Laboratórios Isotope de Cambridge, Inc. Coquetel inibidor de protease (100X) (#78429) e contas de agarose Pierce anti-HA (#26182) foram obtidas da Thermo Scientific. As contas MagStrep ‘Tipo 2HC’ (#2-1612-002) foram obtidas da IBA BioTagnology. Bioconcept Labs Pvt Ltd, Gurgaon, Índia sintetizou o peptídeo HA . A membrana de nitrocelulose (#RPN303E) foi comprada da GE Healthcare. A Trypsin protease (#4370282) foi adquirida da AB Sciex. O marcador de peso molecular da proteína arco-íris completa (#RPN800E) foi obtido de Amersham. SiRNAs, Dharmafect Transfection Reagent (#T-2001-03), RNase Free Water (#B-003000-WB-100), 5X siRNA buffer (#B-002000-UB-100) foram obtidos de Dharmacon. O RNase A (#19101) foi da Qiagen.

Antibodies for Western Blot

Antibodies used in the present study were: anti-HA (#SC-7392; monoclonal de rato, diluição 1:3000); anti-AKT1 (#SC-5298; monoclonal de rato, diluição 1:1000) e anti-GAPDH (#SC-25778; policlonal de coelho, diluição 1:1000) de Santa Cruz; anti-CDC2 (#77055; policlonal de coelho, diluição 1:1000); anti-CCNB1 (#4138; policlonal de coelho, diluição 1:1000) da Cell Signalling Technology; anti-BUB3 (#ab133699; monoclonal de coelho, diluição 1:10000); anti-API5 (#ab56392; monoclonal de rato, diluição 1:1000) e anti-SH3PX1 (#EPR14399; monoclonal de coelho, diluição 1:2000) da Abcam; anticorpos secundários foram obtidos da Licor Biosciences-Odyssey bode anti-rato (#926-32210, diluição 1:15000) e Odyssey bode anti-coelho (#926-32211, diluição 1:15000).

Geração de linha celular estável

Neste estudo, foi utilizado o vector de entrada Akt1 compatível com gateway (pENTR221) para gerar uma expressão construída pela reacção de recombinação LR na presença de um vector de destino adequado (pcDNA/FRT/TO). O vector de destino foi modificado para incluir uma etiqueta Strep-HA (SH) contendo um peptídeo de ligação à estreptavidina (Strep) e uma etiqueta epitoposa de hemaglutinina (HA). Esta tag SH foi eventualmente utilizada para retirar selectivamente o Akt1 e os seus parceiros interactivos de lisados de células complexas. Para gerar uma linha de células de expressão induzível Akt1, a construção da expressão foi co-transferida com recombinase pOG44 em células Flp-In TREx HEK293, expressando de forma estável o repressor Tet. A transfecção foi facilitada pelo reagente de transfecção Xtremegene 9. As células que expressam a construção do Akt1 foram seleccionadas durante um período de 15-20 dias em higromicina-B (75 µg/ml) contendo meio RPMI, suplementado com FBS com 10% de Tet screened FBS. Estas células selecionadas foram posteriormente agrupadas para expandir para experimentos de pulldown.

A concentração Tet necessária para a expressão ótima de Akt1 foi determinada pela indução da expressão de Akt1 em uma faixa de concentrações de Tet (0,1 µg/ml a 5 µg/ml) e os níveis de expressão de proteína de Akt1 foram monitorados na presença e ausência de Tet usando anticorpos anti-Akt1 e anti-HA. O Tet foi suplementado aos meios de cultura a cada 24 horas para manter a expressão constante do Akt.

PDT Experimento

PDT para células HEK293 foi monitorado em células normais versus células superexpressoras de Akt1 durante 72 horas após a administração inicial do Tet. Para cada ponto de observação, um conjunto paralelo de 104 células normais e Akt1-sobrepressoras HEK293 foi semeado em triplicatas, em uma placa de 96 poços em meio DMEM de 100 µl contendo 10% de soro. O Tet foi suplementado com meios de cultura 24 horas após a sementeira e após outro intervalo de incubação de 24 horas, as células foram colhidas como tempo 0. Posteriormente, um conjunto de células, em cultura paralela, foi colhido a cada 24 horas até 72 horas. O PDT foi determinado pela contagem das células em cada ponto de tempo pelo método de coloração azul trypan.

Etiquetagem SILAC para diferenciar a interação entre as fases específicas do ciclo celular Akt1

Células HEK293 com sobre-expressão de Akt1 foram expandidas e cultivadas em meio SILAC contendo isótopos “light” (K0R0), “medium” (K6R6) ou “heavy” (K8R10) de lisina (K) e arginina (R) para pelo menos 5 duplicações de células para permitir a incorporação completa da etiqueta. Com 70% de confluência, o Tet (1 µg/ml) foi suplementado ao meio para induzir a expressão do Akt1. As células rotuladas com K0R0 foram presas na fase G0 por inanição de soro durante a noite, que é um método amplamente utilizado para prender células na fase G042. Para tal, os meios de cultura completos normais foram substituídos por RPMI com soro privado e as células foram mantidas em cultura durante 16-18 horas a 37 °C em atmosfera de 5% de CO2. As células rotuladas com K8R10 foram presas na fase G1/S através da cultura de células durante a noite na presença de 5 µg/ml de aphidicolin; um inibidor reversível da replicação do DNA nuclear eucariótico43. Similarmente, para a parada de G2, 400ng/ml de nocodazol foi suplementado aos meios de cultura de células rotuladas com K6R6 e a incubação foi continuada por 16-18 horas antes da pelotização das células. O nocodazol interfere com a polimerização dos microtubos, parando as células na fase G2/M44. As células presas foram tripsinizadas e contadas separadamente pelo método de coloração azul-tripano. As células presas em diferentes fases do ciclo celular foram então granuladas por centrifugação a 1500 rpm durante 10 minutos. Para cada fase do ciclo celular foram feitas pelotagens múltiplas de células e armazenadas a -80 °C, até serem utilizadas.

Purificação por afinidade marcada com SH

O mesmo número de células Akt1-sobre-expressoras presas nas fases G0, G1/S e G2 foram misturadas em proporção 1:1:1 e lisadas em gelo por 1 hora em tampão IP (150 mM NaCl; 50 mM Tris-HCl pH7,5; 1% NP-40; 1X coquetel inibidor de protease e 1 mM PMSF). O lisado celular foi removido dos detritos após a separação centrífuga a 10.000 rpm por 15 minutos a 4 °C. Os complexos proteicos Akt1 foram purificados seletivamente em conjuntos paralelos, visando Strep e HA tag simultaneamente, conforme instruído nos manuais dos respectivos kits. Resumidamente, os complexos proteicos de Strep-tagged Akt1 foram misturados com contas magnéticas de 100 µl de estreptactina e mantidos durante 1 hora de incubação em um agitador rotativo a 4 °C. Quaisquer interautores não específicos foram lavados durante cinco etapas consecutivas de lavagem com cinco volumes de tampão de lavagem com estreptactina. A proteína Akt1 e seus interatores foram eventualmente eluídos em dois passos de eluição com 125 µl de tampão de eluição por eluição (invitrogênio). Para purificação dos complexos proteicos de HA-tagged Akt1, os lisados celulares limpos foram incubados com 50 µl de esferas de agarose HA pré-lavadas durante 2 horas a 4 °C em um agitador rotativo. Após 3 lavagens rápidas, com dez volumes de tampão TBS-T, os complexos proteicos de Akt1 foram eluídos três vezes com 50 µl de peptídeo de HA (250 µg/ml). As etapas de purificação acima foram realizadas para três dessas réplicas biológicas para purificar a proteína Akt1 e seus parceiros interativos e os eluatos de Strep e HA para cada réplica foram agrupados, liofilizados e salvos a -80 °C até o processamento posterior.

Digestão da proteína e preparação da amostra para LC-MS/MS

Todas as três réplicas biológicas foram processadas para a digestão da proteína separadamente. À amostra liofilizada foram adicionados 40 µl de bicarbonato de amônio 100 mM, bem vortexado, seguido pela adição de 2 µl de tampão desnaturante (AB Sciex). As amostras foram reduzidas com 4 µl de reagente redutor (AB Sciex) durante 1 hora a 60 °C. Foram adicionados 2 µl de reagente de bloqueio de cisteína durante 10 minutos à temperatura ambiente para bloquear os resíduos de cisteína reduzidos. A digestão da proteína foi iniciada adicionando 5 µl de 0,1 µg/µl de Lys C endo-proteinase. As amostras foram mantidas para incubação durante 4 horas num banho de água a 37 °C. Após um curto spin, 1 µl de tripsina (1 µg/µl) foi suplementado às amostras e continuou a incubação por mais 12-16 horas a 37 °C. A digestão da proteína foi terminada pela adição de uma gota de ácido fórmico (FA).

Amostras acidificadas foram liofilizadas e sujeitas a purificação peptídeo utilizando colunas de monoespina C-18. Antes da utilização, as colunas C-18 foram condicionadas com metanol e água e posteriormente equilibradas com 3% de ACN em 0,1% de FA. As amostras liofilizadas foram dissolvidas em 3% de ACN em 0,1% de FA e carregadas nas colunas C-18 e deixadas aglutinar durante 10 minutos. As amostras foram passadas duas vezes através das colunas para garantir a ligação completa. Após 10 lavagens rigorosas com 3% de ACN em 0,1% FA, os peptídeos digeridos foram eluídos primeiro em 40% de ACN, seguidos de duas eluições em 60% de ACN. Finalmente, os três eluatos foram agrupados e liofilizados, para cada réplica.

Os peptídeos eluídos foram re-dissolvidos em 500 µl de formato de amônio 5 mM (pH 2,5) em 30% de AIS e suavemente vortexados. O cartucho de troca catiónica foi fixado e acondicionado antes de carregar a amostra. Após o carregamento da amostra, o cartucho foi lavado três vezes com 5 mM de forma de amónio (1 ml). Peptídeos foram reelutados duas vezes com 400 µl de forma de 500 mM de amônia (pH 2,5) em 30% de ACN por eluição e os eluatos foram agrupados para cada replicado de amostra e liofilizados.

Espectrometria de massa Desenho experimental e lógica estatística

AnáliseLC-MS/MS

Todas as amostras foram analisadas por cromatografia líquida de nano-fluxo num sistema nanoflex (Eksigent Technologies, AB Sciex) acoplado a um Espectrômetro de Massa TOF 5600 (AB Sciex; Concord, Canadá). Cada replicação biológica foi injetada duas vezes como réplica técnica. O sistema foi operado utilizando um gradiente de fase binária, com solvente A (2% ACN em 0,1% FA) e solvente B (98% ACN em 0,1% FA). Para uma ótima reprodutibilidade da amostra, o auto amostrador foi operado em modo de injeção total, preenchendo em excesso o laço de 1 µl com 3 µl de amostra. Para as medidas de cada injeção de amostra, os peptídeos foram presos em armadilha de cHiPLC, 3 µm, Chrom XP C18CL, 120 Å, 0,5 mm × 200 µm (Eksigent) e separados em uma coluna de cHiPLC, 3 µm, Chrom XP C18CL, 120 Å, 15 cm × 75 µm (Eksigent) a 300 nl/minuto de fluxo, usando gradiente linear: 5-60% de solvente B em 80 minutos, 60-90% por 2 minutos. A coluna foi regenerada por lavagem com 90% de solvente B por 6 minutos e re-equilibrada com 5% de solvente B por 22 minutos.

O espectrômetro de massa foi acoplado a uma fonte de íons Nano Spray (AB Sciex), controlada pelo software Analyst (v.1.6). A fonte de íons foi equipada com um 10 μm emissor de PicoTip de eletroospray SilicaTip (AB Sciex) e os peptídeos eluídos foram monitorados seguindo os parâmetros da fonte de íons – IHT = 130°, ISVF = 2100 v, GS1 = 20, gás cortina = 25. O espectrômetro de massa foi operado em modo de aquisição dependente de informação (IDA) top10 e modo de alta sensibilidade com tempo de acumulação de 500 e 200ms para as varreduras MS1 e MS2 respectivamente, e exclusão dinâmica de 12 s, resultando em um ciclo de trabalho total de ~2,55 s. A análise do espectrômetro de massa foi realizada utilizando as varreduras TOF-MS1 e MS2, variando de 350-1250 e 140-1600 m/z, respectivamente. A energia de colisão rolante foi controlada automaticamente pelo script de parâmetros de energia de colisão rolante IDA. Os critérios de seleção para que o íon pai fosse fragmentado incluíam intensidade – onde os íons tinham que ser maiores que 150 cps, tolerância de massa de 50mDa, com um estado de carga de +2 a +5. Uma calibração automática dos espectros foi feita após a aquisição de cada 2 amostras usando LC-MS dinâmico e aquisições MS/MS de 25fmol β-galactosidase.

Processamento e Análise de Dados

A aquisição do Akt1 pelo MS-MS e seus parceiros proteicos interagentes foi mediada em 3 fases diferentes do ciclo celular, ou seja, fase G0, G1/S e G2. As células rotuladas SILAC representando cada fase foram agrupadas em três conjuntos separados e sondadas como réplicas biológicas. A aquisição de cada réplica biológica resultou em 2 arquivos wiff e 2 arquivos wiff.scan, representando suas réplicas técnicas. Os arquivos wiff foram novamente agrupados para cada réplica biológica antes de procurar na base de dados UniProtKB/SwissProt Human (lançamento em abril de 2015) usando o software piloto de proteínas, versão 4.5 (revisão no.1656). A base de dados de referência consistia em 20.204 entradas de proteínas na versão especificada. A pesquisa piloto de proteína foi baseada no algoritmo paragon, uma parte das estatísticas padrão do software. As seguintes configurações foram usadas para buscas de paragon-(a) Espécies como Homo sapiens, (b) Lys C e Trypsin como categorias de enzimas para diferentes execuções, (c) Máximo de clivagens perdidas = 2, (d) Modificações fixas como rótulos SILAC-K6R6 e K8R10; alquilação de cisteína por metilmetiossulfonato (MMTS), (e) Modificações variáveis como oxidação na metionina, que é uma opção padrão no piloto de proteína, (f) Identificação, SILAC (Lys + 6, Arg + 6) e SILAC (Lys + 8, Arg + 10) como tipos de amostra, e (g) Parâmetro “Esforço de Busca” “Identificação Exaustiva”, que nos dá uma ampla busca de várias modificações de proteína, (h) Tolerância de massa para os íons precursor e fragmento foram 0.05 e 0,1 Da, respectivamente. Para cada replicado biológico por SILAC foram gerados arquivos digeridos de Lys C e Trypsin. Os seguintes parâmetros foram empregados para filtrar os dados a fim de obter um conjunto de dados confiável para análise posterior-(a) Algoritmo de correção automática de polarização para relação peso-leve foi aplicado. Ele corrige a mistura desigual durante a combinação das diferentes amostras rotuladas em um experimento e remove qualquer viés experimental ou sistemático. O fator de viés automático aumenta a precisão da quantificação ao normalizar variações nas quantidades iniciais de proteína45, (b) Proteínas a 1% Taxa global de falsa descoberta (FDR) de ajuste (G-FDR-fit) foram retidas. A análise FDR foi realizada utilizando o Proteomics Performance Evaluation Pipeline Software (PSPEP) que é instalado com software piloto de proteína; (c) O limite mínimo de confiança de proteína foi definido para 95%; (d) Identificação de pelo menos um único peptídeo com 95% de confiança nas três réplicas.

Listas de proteínas adquiridas após a digestão de Lys C e Trypsin foram agrupadas por réplica biológica. As razões de quantidade entre as proteínas rotuladas SILAC médias e pesadas em relação às suas equivalentes mais leves foram calculadas como média. Posteriormente, obtivemos três listas de proteínas por SILAC rotulado-K0R0, K6R6 e K8R10. Em seguida, foi preparada uma lista de união das proteínas identificadas; A estimativa quantitativa foi curada manualmente através da fusão de arquivos de três réplicas biológicas para cada condição SILAC. As proteínas que foram identificadas em todos os três conjuntos de réplicas foram retidas para análise posterior e as proporções quantitativas entre etiquetas médias e pesadas em relação às etiquetas leves para essas proteínas foram calculadas como média. Um arquivo final combinado foi então preparado para K0R0 (fase G0), K6R6 (fase G2) e K8R10 (fase G1/S). Uma proteína qualificada para estar na lista final de interatores Akt1 somente se ela foi identificada em todos os 3 conjuntos de réplicas para qualquer uma das fases do ciclo celular. As proteínas que foram identificadas mas não quantificadas nas três réplicas receberam um valor de quantificação de 0,01 (mínimo) ou 100 (máximo) após a intrusão nas proporções do peptídeo SILAC.

Para podar a lista de interatores Akt1 de qualquer interação não específica com a matriz de afinidade ou tag per se, SH tagged GFP foi super-expressa em células HEK293. Os parceiros interativos da proteína GFP foram seletivamente eluídos como descrito para os complexos proteicos Akt1. As proteínas que se sobrepuseram com o interacionador específico da fase do ciclo celular Akt1 foram removidas da lista de interacionadores Akt1 como proteínas não específicas. Isto finalmente nos deu um conjunto de dados confiantes para parceiros de interação para o Akt1. Um resumo das informações sobre as proteínas que interagem com o Akt1 e suas estimativas de quantificação é fornecido na Tabela Suplementar 3. Dividindo-as com a proporção de Akt1 na respectiva fase, normalizamos as proporções quantitativas para todos os interatores de Akt1. Isto deu uniformidade ao Akt1 como 1 nas fases G0, G1/S e G2.

Polyacrylamide Gel Electrophoresis and Western blotting

Da lista de interatores de Akt1 identificados, CDK1, CCNB1, BUB3, API5 e SH3PX1 foram selecionados aleatoriamente para validar sua associação com o Akt1 por western blotting. O Akt1 assíncrono expressando a pelete celular foi lisado em buffer IP e submetido a purificação por afinidade visando a marca SH, como descrito anteriormente. Os eluatos foram agrupados e diluídos em 1X tampão de amostra SDS e aquecidos por 10 minutos e resolvidos com 10% de SDS-PAGE. As bandas proteicas foram transferidas para a membrana de nitrocelulose e esta última foi bloqueada usando tampão de bloqueio 1:1 odyssey: PBS durante uma hora à temperatura ambiente. Em seguida, a membrana foi cortada para permitir que as proteínas de diferentes tamanhos fossem sondadas com os respectivos anticorpos primários para validar juntamente com os anticorpos anti-HA. A diluição do anticorpo primário foi feita em tampão odyssey: PBST e incubada durante a noite a 4 °C num agitador. Após lavagem completa, as bolhas foram expostas aos respectivos anticorpos secundários anti-rato ou anti-corpos de coelho rotulados com IR a uma diluição de 1:15000; diluídos em tampão odyssey: PBST. As faixas foram detectadas usando odyssey infravermelho scanner.

Coimunoprecipitação reversa também foi feita usando a proteína A da Dynabeads. Os interatores Akt1 previamente detectados foram usados como proteínas de isca e Akt1 foi sondado como seu parceiro interativo usando o anticorpo anti-Akt1. Os anticorpos contra os interatores Akt1 selecionados foram misturados com 50 µl de dynabeads em tubos separados a uma concentração de 1:20-1:70; diluídos em 200 µl PBST. As misturas de esferas-anticorpos foram mantidas para incubação à temperatura ambiente durante 10 minutos. Os complexos de esferas-anticorpos foram granulados usando um separador magnético e ressuspendidos em 200 µl PBST para lavagem. Em seguida, 250 µl de lisado foram adicionados a cada tubo e mantidos para incubação a 4 °C durante 2 horas num agitador rotativo. As esferas, juntamente com os respectivos complexos anti-corpo-antigénios, foram novamente granuladas e lavadas três vezes com 200 µl de PBST, por lavagem. Em seguida, os grânulos foram fervidos em 50 µl de 1X tampão de amostra SDS durante 10 minutos e, em seguida, resfriados. O sobrenadante foi carregado em 10% de SDS-PAGE e sondado por mancha ocidental. Anticorpo Anti-Akt1 foi usado para sondar para Akt1 na eluição de API5, CCNB1, CDK1, BUB3 e SH3PX1.

GO Classification

GO classes representando a função de cada interator Akt1 foram determinadas a partir de bases de dados UniProt (http://www.uniprot.org/) e EnrichR (http://amp.pharm.mssm.edu/Enrichr/). Após extensa cura manual, os interatores Akt1 identificados foram segregados em 3 classes funcionais principais, ou seja, proliferação e sobrevivência; metabolismo; e síntese de proteínas. As demais foram descritas como uma classe comum chamada ‘outras’ que incluía proteínas com funções como transporte, hematopéia, etc.

Botão do gene usando siRNA

Padronização

Para determinar a concentração ótima de siRNA para transfecção, 1,2 × 105 células HEK293 foram semeadas em uma placa de 12 poços. Uma gama de concentrações de siRNA de 10 nM a 50 nM foi transfectada usando reagente de transfecção dharmafect, de acordo com o protocolo do fornecedor. As alterações nos níveis de expressão de proteínas foram monitorizadas por mancha ocidental às 24 horas, 48 horas e 72 horas, respectivamente (Figura Complementar 2). Poucos outros alvos (SH3PX1, AKT1, CCNB1 e SLC25A5) foram derrubados e o efeito da derrubada foi determinado pelo western blotting. GAPDH foi usado como controle de carga.

Knockdown das proteínas alvo

Proteínas mostrando associação perturbada com Akt1 enquanto a célula progrediu da fase G0 para G1/S do ciclo celular foram derrubadas individualmente em células HEK293 e investigadas por FACS. Cada siRNA foi ressuspenso em 1x tampão de siRNA para obter uma concentração de estoque de 20 µM. A transferência foi mediada em triplicações 24 horas após a semeadura das células; junto com os controles positivos e negativos apropriados. Cada siRNA foi diluído a uma concentração de trabalho de 25 nM em RPMI para fazer o volume final 50 µl e mantido à temperatura ambiente durante 5 minutos de incubação. Da mesma forma, o reagente de transfecção também foi diluído em RPMI para fazer um volume de 50 µl e mantido para incubação em condições semelhantes. Tanto o siRNA como o reagente de transfecção foram misturados suavemente para formar complexos e continuar a incubação por mais 20 minutos à temperatura ambiente. O volume final foi feito até 500 µl com meio contendo 10% de soro. Estes complexos foram então suavemente adicionados às células e continuaram a incubação a 37 °C. Os meios de cultura celular foram substituídos por meios frescos com 10% de soro após 24 horas. Finalmente, 48 horas após a transfecção, a eficiência da transfecção foi determinada pela monitorização do siGLO sob microscópio invertido Nikon Ti.

FACS aquisição e análise

Em 48 horas após a transfecção, as células foram brevemente centrifugadas e os meios foram aspirados. As células foram coradas com 300 µl de solução de iodeto de propidio contendo 0,1 mg/ml de iodeto de propidio (Sigma), 3 µl/ml de Triton-X 100 (Sigma), 1 mg/ml de citrato de sódio (Sigma) e 20 µg/ml de RNase (Sigma) por 30 minutos a 4 °C. As células coradas foram imediatamente transferidas para tubos BD FACS e adquiridas em BD FACS Canto.

Os dados obtidos foram analisados usando o software FlowJo. Os histogramas de DNA foram analisados para quantificar as populações sub G0, G0/G1, S e G2/M. Pequenos desvios foram observados nas populações G0/G1 e G2/M e, portanto, foi feita a análise manual dos portões para essas populações.

PDT e RT Cálculo

PDT e RT nas fases G1, S e G2 do ciclo celular foram calculados após a derrubada do siRNA do conjunto de proteínas mostrando associação perturbada com Akt1 na fase G1/S. O PDT para os 23 genes, juntamente com os controles, foi monitorado em células HEK293 ao longo de 72 horas de duração. Em resumo, 10.000 células foram semeadas em uma placa de 96 poços, em 100 µl de mídia RPMI com 10% de soro. A transfecção de siRNA foi mediada no dia seguinte em triplicata para cada proteína alvo e foi considerada como ponto de tempo 0 hora. A contagem de células foi determinada para células HEK293 não tratadas pelo método de coloração azul tripano. Após 24 horas, os meios de cultura celular contendo complexos de siRNA foram substituídos por RPMI fresco contendo 10% de soro. Em seguida, as células foram contadas para cada uma das células de siRNA transfectadas para representar o ponto de tempo de 24 horas. Assim, um conjunto de células, funcionando em cultura paralela, foi colhido e contado em 48 horas e 72 horas de tempo, respectivamente.

Once PDT foi determinado para todo o conjunto alvo de genes perturbados, RT (em horas) para cada um foram calculados para as fases G1, S e G2 como se segue:

where; % da população de células foi determinada pela aquisição da FACS.

Dados disponíveis

Os dados de espectrometria de massa foram depositados como um conjunto de dados “Definindo a interação Akt1 e delineando alterações em sua composição em função da progressão do ciclo celular” para ProteomeXchange através da base de dados PRIDE. Está disponível publicamente através do ProteomeXchange com o identificador ProteomeXchange: PXD005557. O conjunto de dados é composto por 12 arquivos brutos (wiff e wiff.scan) e 18 arquivos piloto de proteína associados.