6.2.3 Cowpea Mosaic Virus

Cowpea mosaic virus (CPMV; Comovirus, Comoviridae) é a plataforma mais estudada para várias conjugações e aplicações biotecnológicas. É um vírus icosaédrico de 30 nm e consiste num genoma de RNA bipartido de sentido positivo, de cadeia única, com cada molécula de RNA encapsulada numa partícula separada. CPMV capsid é composto de 60 cópias cada uma de duas subunidades diferentes de CP (denominadas pequenas, 24 kDa, e grandes, 42 kDa) com pseudo T = 3 simetria icosaédrica. Devido à presença de natureza altamente simétrica e heteromérica do capsid, a CPMV oferece uma oportunidade notável para introduzir diferentemente (em cinco ou três vezes ou ambas as posições) múltiplos tipos de funcionalidades por engenharia genética e química específica com controle tanto sobre a distribuição espacial quanto sobre o grau de multivalência (Uchida et al., 2007; Young et al., 2008; Steinmetz, 2010; Wen et al., 2016). A CPMV pode ser purificada em grandes quantidades a partir de folhas infectadas e é estável em ampla faixa de temperaturas (até 60°C) e na faixa de pH de 3,0-9,0 e pode suportar alguns solventes orgânicos (Steinmetz et al., 2009). Os capsids de CPMV são utilizados para imobilização controlada de enzimas activas. A utilização de capsids de CPMV para a fabricação de nanopartículas metálicas por deposição electroless (ELD) e mineralização por diversos processos permitiu a produção de camadas finas de metais e ligas com espessura e composição uniformes. Os viriões CPMV são utilizados como blocos nanobuilding para a construção controlada de estruturas 2-D e 3-D usando uma abordagem bottom-up, camada por camada (LbL) para aplicações potenciais como dispositivos nanoelectrónicos ou múltiplos biossensores electroquímicos (revisto em Culver et al., 2015; Wen et al, 2015a, 2016; Narayanan e Han, 2017a).

Partículas nativas de CPMV e CPMV derivadas com complexos metálicos de lantanídeos foram consideradas seguras e não tóxicas, com base nos estudos de biodistribuição, toxicidade e patologia dessas partículas in vivo (Rae et al., 2005; Singh et al., 2007). A CPMV foi encontrada associada a regiões de inflamação e disrupção da barreira hematoencefálica durante infecção do sistema nervoso central (SNC) em camundongos (Shriver et al., 2009). A CPMV com PEGylation superficial mostrou baixa imunogenicidade, e a internalização foi prevenida em vários tipos de células devido à redução da ligação não específica (Raja et al., 2003). Manchester e colegas de trabalho descobriram que a CPMV rotulada fluorescentemente tem capacidade endógena para ser absorvida por células endoteliais vasculares e pode ser usada como uma sonda de imagem intravital para visualizar a vasculatura e o fluxo sanguíneo a uma profundidade de até 500 μm por 72 h em embriões vivos de camundongos e pintos (Lewis et al., 2006). Foi descoberto que a CPMV tem uma capacidade natural de se ligar à vimentina superficial, uma proteína citoesquelética que modula a arquitetura e a dinâmica das células, e foi encontrada superexpressa em células endoteliais, cancerosas e inflamatórias (Koudelka et al., 2009). A interação biocompatível e natural com vimentina e características de retenção do endotélio da CPMV tem sido mais explorada para a imagem de angiogênese tumoral e homing in vivo (Leong et al., 2010; Steinmetz et al., 2011; Yildiz et al., 2011; Wen et al, 2015a).

A superfície exterior do capsido de CPMV foi extensivamente modificada usando lisina, cisteína, tirosinas e resíduos de ácido aspártico e glutâmico, usando métodos padrão de conjugação química e conjugação de reticulados para fixar vários reagentes, tais como nanopartículas de Au, moieties metil viologen reactivas redox, moieties organometálicas de ferroceno, fluoróforos, biotina, cadeias de PEG, derivados de estilbeno, hidratos de carbono, proteínas heterólogas (e.g., holo-transferrina humana, lisozima T4, o dominio LRR da internalina B e o produto do gene Intron 8 do receptor da tirosina quinase HER2), anticorpos, oligonucleotídeos, pontos quânticos semicondutores e fulerenos. A incorporação de aminoácidos não naturais em CPMV capsid foi realizada através de múltiplas químicas ortogonais (tais como a estratégia de ligação quimoselectiva de hidrazona e a estratégia de ligação de cobre-catalítico azídico-alquídico (CuAAC) ou a reacção “click”). Estes esforços têm facilitado o uso de partículas de CPMV como sondas ópticas, candidatos a vacinas e nanodispositivos de memória e sensores (revisto em Young et al., 2008; Destito et al., 2009; Grasso e Santi, 2010; Steinmetz, 2010; Lomonossoff e Evans, 2011; Wen et al., 2015a; Zhang et al., 2016; Lee et al., 2016b; Narayanan e Han, 2017a). CPMV e TMV foram carregadas para transportar agentes de contraste para ressonância magnética (MR) de dupla modalidade e imagem óptica, e ambas as modalidades demonstraram a especificidade da ligação de fibrina in vitro com a presença de peptídeos alvos. Estudos pré-clínicos em um modelo de lesão fotoquímica da artéria carótida com trombose confirmaram a localização de trombos das nanossondas, com as hastes alongadas da VTM exibindo uma ligação significativamente maior aos trombos do que a VPMV icosaédrica (Wen et al., 2015b,c). A CPMV decorada com peptídeos E7p72 (domínio 7 (EGFL7) de ligação do peptídeo que visa especificamente as células endoteliais humanas), voltada para a neovasculatura associada a tumores com alta especificidade, avaliada por imagem intravital (Cho et al., 2017).

Protocolos de montagem in vitro e in vivo para subunidades capsidiais de CPMV ainda não estão bem estabelecidos. Isto tem limitado seu potencial de utilização como nanocontainer para encapsulamento de moléculas de carga. O conteúdo de ácido nucléico nativo de viriões CPMV foi usado como esponja eletrostática para atrair agentes de imagem e moléculas terapêuticas através de técnica de infusão simples (Yildiz et al., 2013). A coexpressão transitória do precursor da CPMV (VP60) que consiste em proteínas grandes e pequenas fundidas e proteinase 24K para processamento proteolítico da VP60 em plantas resultou em CPMV VLPs (eCPMV), que eram completamente desprovidas de RNA (vírus ou hospedeiro) (Saunders et al., 2009). Tais capsids vazias foram usadas para transportar uma ampla gama de moléculas de carga, tais como metais, corantes fluorescentes ou drogas (Culver et al., 2015; Wen et al., 2015a; Narayanan e Han, 2017a). Fluoróforos, etiquetas de afinidade de biotina, PEG e vários peptídeos foram exibidos seletivamente na superfície interior do CPMV vazio, visando lisinas reativas (Wen et al., 2012b). A eficácia do eCPMV como vacina in situ foi demonstrada em modelos de camundongos de melanoma metastático, câncer de mama, câncer de ovário e câncer de cólon, onde induziu resposta imune antitumoral ao desencadear ativação e infiltração de neutrófilos, resultando em um perfil quimiocinético que leva à ativação da imunidade adaptativa. A maioria dos ratos rechaçados com tumores no flanco oposto rejeitaram completamente o tumor rechaçado (Lizotte et al., 2016). A entrega intratumoral de nanopartículas magnéticas (mNP) para induzir hipertermia e eCPMV em combinação melhorou a eficácia do tratamento tumoral local e sistêmico (retardo do crescimento secundário do tumor (efeito abscopal) e resistência ao rechallenge tumoral) no camundongo C3H/MTG-B adenocarcinoma mamário e modelos de células de melanoma modelo C57-B6 camundongo/B-16-F10 (Hoopes et al., 2017a). Usando oito cancros caninos espontâneos (dois melanomas orais, três amelioblastomas orais e um carcinoma), Hoopes et al. (2017b) demonstraram que a radiação hipofracionada e a hipertermia induzida por mNP e o tratamento eCPMV intratumoral em combinação foram mostrados para obter melhores respostas imunológicas.

Para usar a CPMV para o fornecimento de drogas às células cancerosas e para superar a interação natural entre a CPMV e as células de mamíferos, uma reação de “clique” foi usada para conjugar o PEG e a fragilidade dos ligamentos foliares (CPMV-PEG-FA) à CPMV. Essa conjugação permitiu o direcionamento específico da CPMV para receptores de folato (FRs) expressando células HeLa e KB (Destito et al., 2007). O alvo da CPMV para as células tumorais do neuroblastoma foi alcançado pela modificação genética da CPMV para exibir o neuropeptídeo Y (NPY) análogo como um ligante alvo. Foi demonstrado que o CPMV-NPY interagia especificamente com células SK-N-MC que superexpressavam o receptor Y1 (Destito et al., 2009; Ma et al., 2012). A imagem do receptor-alvo foi obtida pela ancoragem de seqüências curtas de peptídeos (F56 e bomba específica ao receptor-1 do fator de crescimento endotelial vascular (VEGFR-1)) e receptores peptídeos liberadores de gastrinas (GRPR), respectivamente, à CPMV. Esses sensores baseados na CPMV foram encontrados em ligação específica com as células cancerígenas que estão superexpressores desses receptores na superfície celular (Brunel et al., 2010; Steinmetz et al., 2011). Wen e Steinmetz (2014) desenvolveram uma abordagem bottom-up para a síntese de nanopartículas de CPMV, dímeros e conjuntos contendo ligandos-alvo (peptídeos cíclicos RGD), e corantes fluorescentes e descobriram que a apresentação simétrica dos peptídeos RGD e a dimerização das nanopartículas aumentou a eficácia da mira das células cancerígenas.

CPMV tem sido usada com sucesso para a exibição de vários peptídeos heterólogos para induzir resposta imune. A imunização de animais com cada uma das quimeras induziu uma forte resposta imune humoral que foi protetora contra o desafio pelo respectivo patógeno. A exposição multivalente de moléculas antivirais e carboidratos em CPMV facilitou a sua utilização para aplicações terapêuticas (Lomonossoff e Evans, 2011; Koudelka et al., 2015; Hefferon, 2017). Aljabali et al. (2013) estabeleceram a conjugação covalente de dox à CPMV através de uma ligação amida ou ponte de dissulfeto usando lisina ou resíduos de cisteína na superfície externa da CPMV. A CPMV carregada com dox apresentou um efeito de eliminação de células maior do que a dox livre mesmo em dosagens baixas. A CPMV modificada com uma coroa de dendros carregados negativamente foi usada para carregar fotossensibilizadores carregados positivamente (para terapia fotodinâmica (PDT)). Este sistema híbrido portador de PDT-CPMV foi eficaz para matar células de melanoma e macrófagos in vitro (Wen et al., 2016). Para superar a toxicidade não específica dose-limitante do cromo trivalente (um nutriente mineral benéfico), que pode inibir seletivamente a proliferação de células musculares lisas da aorta humana (HASMC) de alto teor de glucose-induzidas in vitro, O cloreto de cromo foi carregado na cavidade interna da CPMV via infusão, e as partículas resultantes de CPMV-Cr (CPMV-Cr) carregadas com CrCl3 reduziram significativamente a proliferação de HASMC induzida pelo glucos e apresentaram efeitos antiaterogênicos sob condições hiperglicêmicas (Ganguly et al., 2016).