gene mecA PCR

Um fragmento de 188-bp dentro do gene mecA e um fragmento de 178-bp dentro do gene S. aureus específico do gene Sa442 foram amplificados para isolados 1 e 2 em reações separadas em um LightCycler (Roche Diagnostics GmbH, Roche Molecular Biochemicals, Mannheim, Alemanha) usando verde SYBR com primers Mec-S e Mec-A ou Sa442-F e Sa442-RS, respectivamente, como descrito anteriormente (5). isolados mecA-positivos geram temperaturas de fusão verde SYBR de 79°C. Sa442-positivos também geram uma temperatura de fusão SYBR verde de 79°C. S. aureus ATCC 29213 (oxacillin susceptible) e S. aureus ATCC 43300 (oxacillin resistant) foram usados como controles para o gene Sa442 e como controles negativos e positivos, respectivamente, para o gene mecA. Ao contrário dos controles, nenhum produto mecA ou Sa442 foi gerado para os isolados 1 e 2. Foi realizada uma PCR adicional para detectar um fragmento maior de 533-bp do gene mecA (4). Nenhum produto foi gerado nos isolados 1 e 2 ou S. aureus ATCC 29213, mas um produto do tamanho esperado foi gerado de S. aureus ATCC 43300. O gene 16S rRNA, usado como controle positivo, foi amplificado de todas as linhagens (dados não mostrados).

Detecção precisa e oportuna da resistência à meticilina em S. aureus é uma função importante do laboratório de microbiologia clínica (20). Enquanto a detecção do gene mecA por PCR é o padrão ouro, o teste de aglutinação PBP2a em látex demonstrou ser um teste simples e rápido, com boas características de desempenho para detectar resistência à meticilina tanto em S. aureus como em espécies estafilocócicas coagulósicas negativas, apesar da necessidade de indução prévia em alguns casos (1, 21). O ensaio PBP2a utiliza partículas de látex sensibilizadas com anticorpos monoclonais levantados contra PBP2a (11). A especificidade deste teste aproxima-se de 100% (18, 19). Embora não haja relatos sobre o desempenho dos testes de aglutinação de látex PBP2a para isolados de S. intermedius, foram observados resultados falso-positivos de PBP2a com dois isolados de S. warneri, um a 1 min e outro a 6 min, que foram ambos mecA PCR negativos com um MIC de oxacilina de ≤0.5 μg/ml (21). De acordo com a bula do fabricante, as reacções falso-positivas são geralmente aglutinações fracas que são frequentemente negativas em testes repetidos com uma cultura fresca. No entanto, descobrimos que os nossos dois isolados foram repetidamente positivos após múltiplas subculturas, sendo um deles fortemente positivo. A estirpe S. intermedius ATCC 29663 foi, de fato, negativa pelo teste PBP2a, mas também foi fenotípicamente diferente das duas cepas clínicas no que diz respeito à fermentação positiva do manitol, à negatividade da lactamase β e à sensibilidade à penicilina (resultados não mostrados).

Coagulase positiva é comumente usada para atribuir significância clínica e patogenicidade aos isolados de Staphylococcus spp. Enquanto S. aureus é o estafilococo coagulase positivo mais comum isolado no laboratório clínico, S. intermedius, S. delphini, S. schleiferi subsp. coagulans, S. lutrae, e algumas cepas de S. hyicus também são coagulase positiva (1). Os laboratórios usam frequentemente uma combinação de testes para detectar coagulase livre ou fator de aglomeração com e sem proteína A para identificar estafilococos coagulase positivos. S. intermedius isolados são positivos para a coagulase livre, mas são negativos para a proteína A, e 14% dos isolados têm um fator de aglomeração, que seria responsável pela coagulase positiva da lâmina e o látex BACTi Staph positivo fraco para o isolado 1 (6). Como descrito anteriormente, encontramos a positividade da pirrolidonil arylamidase como uma forma rápida de determinar que um estafilococo coagulase positivo não é S. aureus (10). Acreditamos que nossos casos sugerem que a verdadeira incidência de S. intermedius nas infecções de feridas humanas é provavelmente subestimada, pois todos os estafilococos coagulopositivos são frequentemente agrupados como S. aureus (17). Na ausência de identificação definitiva de S. intermedius por métodos fenotípicos ou bioquímicos, o sequenciamento do gene 16S rRNA foi considerado útil para a classificação taxonômica das espécies Staphylococcus e Macrococcus (8).

Um estudo inicial em 1989 mostrou que 72% dos isolados de S. intermedius da gengiva canina e infecções de feridas infligidas por caninos eram suscetíveis à penicilina, e nenhum era resistente à oxacilina (16). Um estudo mais recente revelou que a resistência à oxacilina é um problema crescente nos isolados de S. intermedius, com taxas 60 a 85% maiores de resistência à oxacilina observadas para isolados de nariz, olhos e abcessos de cães em comparação com aqueles dos outros locais (7). Na primeira infecção humana devido à S. intermedius resistente à meticilina, onde foi o agente causador da pneumonia, a oxacilina MIC foi 32 μg/ml (3). Ambos os nossos isolados eram resistentes à penicilina e eram β-lactamase positivos; a oxacilina MIC para estes isolados era 0,125 μg/ml. A resistência à penicilina nestes isolados, na ausência de resistência à oxacilina com uma PCR mecA negativa e susceptibilidade às combinações inibidoras de β-lactam/β-lactamase, pode ser explicada pelo achado positivo do ensaio de β-lactamase. Usando o conjunto de iniciadores visando um fragmento de 533-bp do gene mecA, Gortel et al. confirmaram que o gene mecA confere resistência à meticilina em estafilococos isolados de cães (4). Estes investigadores descobriram que entre 10 cepas estafilocócicas coagulopositivas portadoras de mecA, 9 eram S. aureus e 1 era S. intermedius. Eles levantaram a hipótese de que a diferença na prevalência de resistência à meticilina em S. intermedius em comparação com a de S. aureus era devida a uma diferença na regulação de mecA entre as espécies ou à falta de intensa pressão de seleção antibiótica em S. intermedius (4). Embora não existam critérios interpretativos NCCLS específicos para estafilococos coagulopositivos além de S. aureus, os resultados dos testes de susceptibilidade à oxacilina pelos métodos fenotípicos e genotípicos (PCR do gene mecA usando dois conjuntos de primers visando fragmentos de 188- e 533-bp), combinados com MICs de baixa oxacilina em comparação com os anteriormente relatados para S. oxacillin-resistant. intermedius isolates (MIC > 4 μg/ml), estabelece os isolados 1 e 2 neste estudo como sensíveis à oxacilina (3, 4).

É bem aceito que a resistência à meticilina em S. aureus se deve principalmente à aquisição de uma proteína adicional de ligação à penicilina, PBP2a, codificada pelo gene mecA. Uma busca pela origem do gene mecA levou à identificação de um possível precursor evolutivo em S. sciuri, um comensal de animais. O homólogo mecA em S. sciuri mostrou 79,5% de sequência de DNA semelhante ao gene mecA de S. aureus e 88% de identidade de aminoácidos com PBP2a. O homólogo mecA de S. sciuri não confere resistência à meticilina na natureza. No entanto, Couto et. al identificaram S. sciuri resistente à meticilina isolada de humanos, onde a superexpressão do homólogo mecA resultante da inserção de um elemento IS256 a montante do gene estrutural ou alterações de nucleotídeos únicos na região promotora resultou na produção de uma proteína funcionalmente parecida com PBP2a (2). Similar aos isolados de S. sciuri, os isolados de S. intermedius aqui descritos podem conter um homólogo mecA que codifica uma proteína PBP2a, que reage cruzadamente com o teste de aglutinação PBP2a de látex, mas não confere resistência à meticilina. Também é possível uma imitação antigênica com uma proteína completamente não relacionada. Em ambos os casos, esperamos conscientizar a comunidade microbiológica de que existem isolados clínicos que podem desafiar a especificidade do teste de aglutinação em látex PBP2a.

Em conclusão, fornecemos o primeiro relatório de resultados falsos positivos de PBP2a para duas cepas de S. intermedius que, combinados com um erro inicial na interpretação dos testes fenotípicos, levaram a uma identificação errada como MRSA. Resultados de PBP2a falso-positivos poderiam levar a tentativas de controle de infecção mal direcionadas, uso desnecessário de antibióticos como vancomicina, e um aumento geral das despesas hospitalares (20). Esses casos ressaltam a importância de buscar ativamente resultados discrepantes de testes laboratoriais para evitar a comunicação de erros. A identificação precisa das espécies de estafilococos coagulopositivos é essencial para determinar a patogenicidade, significado clínico, padrões de susceptibilidade e epidemiologia dos isolados clínicos.