Identificação, análise filogenética e classificação grupal dos genes bZIP em A. duranensis e A. ipaensis

Baseado em pesquisas homológicas e verificação de domínio, um número total de 50 e 45 genes bZIP únicos foram identificados nos genomas A. duranensis e A. ipaensis, respectivamente. Os detalhes para estes genes, incluindo a identificação do gene, posição genômica, composição do domínio e classificação do grupo, são fornecidos no arquivo adicional 1. De acordo com o sistema de nomenclatura existente, nós atribuímos nomes únicos a cada um desses novos genes bZIP: AdbZIP1-50 e AibZIP1-45. Após verificar os domínios bZIP, 93 genes tinham um domínio bZIP típico, incluindo um motivo N-× 7-R/K invariante na região básica e uma repetição heptad de Leu posicionou exatamente nove aminoácidos a montante de R/K em direção ao terminal C (arquivo adicional 2). Os dois genes bZIP restantes, AdbZIP28 e AibZIP22, tiveram uma substituição incomum na região básica: uma substituição do Arg/Lys conservado (R/K) por IIe (I). Esta substituição também foi relatada em outras espécies .

Uma investigação sistemática da família de genes bZIP foi realizada pela primeira vez em Arabidopsis . Nesta análise, diferentes grupos de genes bZIP foram distinguidos e nomeados com base em suas relações filogenéticas e divergências funcionais. Desde então este sistema de classificação foi adotado para outras espécies com base no agrupamento dos genes bZIP dos seus próprios genomas e do Arabidopsis . Aqui, com base na análise de máxima verosimilhança (ML) das proteínas bZIP dos genomas Arachis e Arabidopsis, identificamos 11 clades distintos de genes bZIP (grupos A-I, S, e U), todos com alto suporte bootstrap (Fig. 1). A classificação subgrupo de bZIPs de Arachis foi ainda confirmada pela reconstrução filogenética de árvores após a adição de bZIPs de soja (arquivo adicional 3). A maioria dos clades bZIPs incluem bZIPs de Arachis intimamente relacionados e seus ortologs de Arabidopsis; clades E e F não têm membros correspondentes em A. duranensis ou A. ipaensis. Notavelmente, os genes bZIP dentro do mesmo clade compartilham características sequenciais similares específicas do grupo, incluindo estrutura exon/intron, fases intron, motivos MEME, e predição da estrutura do local de ligação (mais adiante analisado). Este padrão de agrupamento de grupos interespecíficos sugeriu que as características específicas do grupo surgiram antes da divergência de Arachis e Arabidopsis. Entretanto, várias diferenças também se acumularam nos genes bZIP das diferentes espécies vegetais ao longo do tempo evolutivo.

Estrutura genética dos genes Arachis bZIP

Como a organização intron e exon pode indicar a trajetória evolutiva dos genes bZIP , examinamos a estrutura dos genes Arachis bZIP, incluindo número de intron, comprimento e fase de emenda (arquivo adicional 4). Descobrimos que as estruturas gerais dos genes Arachis bZIP eram idênticas ou similares para os Arachis bZIPs dentro do mesmo grupo filogenético. Considerando o número de introns de bZIPs de amendoim, 24% dos AdbZIPs e 22% dos AibZIPs eram intronless, ocorrendo exclusivamente nos grupos S e B. Entre os genes contendo introns, o número de introns variou de 1 a 13 nos genes AdbZIP e AibZIP. Os genes bZIP no grupo G tinham o maior número de introns, consistente com observações em outros genomas de leguminosas .

As fases de emenda foram designadas como três fases de emenda: fase 0 (P0), a emenda ocorreu após o terceiro nucleotídeo do códon; fase 1 (P1), a emenda ocorreu após o primeiro nucleotídeo do códon; e fase 2 (P2), a emenda ocorreu após o segundo nucleotídeo. As fases dos locais de emenda dentro dos quadros de leitura abertos (ORFs) eram diversas, mas eram altamente conservadas nas regiões básicas e dobradiças do domínio bZIP, pois qualquer alteração nessas regiões afetaria seu código e função. Com base na posição intron e presença ou número de fases de emenda no domínio bZIP, quatro padrões intron (a a d) nos genes bZIP Arachis foram identificados (Fig. 2 e arquivo adicional 2). O padrão a teve apenas um intron inserido na posição – 5 da região da dobradiça, entre os aminoácidos Gln e Ala; este padrão foi identificado em todos os genes Arachis bZIP nos grupos A e G. O padrão b teve duas inserções de intron com fase 0, uma na região básica e outra na região da dobradiça; este padrão foi identificado em todos os genes bZIP do grupo D. O padrão c tinha um único intron inserido na posição – 20 na região básica na fase 2 (P2), e contém todos os genes bZIP nos grupos C e H. O padrão d não tinha introns nas regiões básica e dobradiça, e inclui todos os genes bZIP nos grupos B e S. Além disso, a maioria dos bZIPs Arachis exibindo o padrão d eram intronless, exceto para AdbZIP45 e AibZIP40. Cada um destes genes tinha um intron fora das regiões básicas e de dobradiças. Os padrões de fase de emenda no domínio Arachis bZIP aqui observados eram consistentes com os observados em outras espécies . A alta conservação da estrutura gênica e das fases intron dentro das clades filogenéticas suportou a classificação de grupo aceita, e sugeriu que estes diferentes padrões de emendas exon podem desempenhar um papel importante na evolução funcional.

As composições de motivos para diferentes grupos de Arachis bZIPs

Além do domínio bZIP, muitos motivos conservados adicionais foram detectados nos genes bZIP pela ferramenta de análise MEME. Como mostrado na Fig. 3, um total de 18 motivos conservados fora do domínio bZIP foram identificados, e as composições dos motivos de consenso para cada subgrupo foram construídas (arquivo adicional 5). Estes motivos de consenso indicaram que as composições gerais dos motivos eram semelhantes dentro do mesmo subgrupo, mas diferentes entre diferentes grupos. Isto sugeriu que a divergência funcional dos genes bZIP pode ser determinada por motivos específicos do grupo. O exame individual desses motivos indicou que muitos eram específicos do grupo. Por exemplo, os motivos 1, 2, 3 e 10 foram identificados apenas no grupo D; os motivos 5, 14 e 15 foram identificados apenas no grupo G; o motivo 6 foi identificado apenas no grupo I; e o motivo 9 foi identificado apenas no grupo H. Vários motivos podem estar associados a funções biológicas específicas. Por exemplo, o motivo 1 é o domínio DELAY OF GERMINATION (DOG) 1, que é necessário para a indução de dormência e múltiplos aspectos da maturação das sementes, em parte por interferir com os componentes de sinalização ABA . O motivo 3 contém potenciais sítios de fosforilação de caseína quinase II (CK II) (S/TxxD/E), que desempenham um papel fundamental na divisão e expansão celular e afectam diversas vias de desenvolvimento e resposta ao stress . Curiosamente, estes motivos específicos de grupo também foram identificados em bZIPs do mesmo grupo em outros genomas de leguminosas, sugerindo que a composição do motivo é conservada através de leguminosas.

Arachis bZIP DNA-binding-site structure and dimerization properties

A região básica do núcleo e a região da dobradiça do domínio bZIP determinam independentemente a especificidade da ligação ao ADN, como demonstrado por vários experimentos . A substituição incomum dos dois sítios invariantes, asparagina (Asn/N; posição: – 18) e arginina (Arg/R; posição: – 10), alterou as especificidades de ligação do ADN . Alinhamos as sequências de aminoácidos das regiões básicas e dobradiças das proteínas bZIP do amendoim para identificar resíduos de aminoácidos conservados e polimórficos dentro de cada grupo (arquivo adicional 6). Não foram observadas substituições de Asn/N na posição – 18 em quaisquer bZIPs de amendoim. Entretanto, todos os membros do grupo I tinham lisina (Lys/K) ao invés de arginina (R) na posição – 10, consistente com os bZIPs do grupo I de outras espécies de leguminosas. Além disso, AdbZIP28 e AibZIP22 (grupo U) tinham um resíduo hidrofóbico de isoleucina (Ile/I) em vez de arginina (Arg/R), e tal substituição demonstrou inibir completamente a afinidade de bZIP para AP1 em leveduras e não reconhece caixas G em arroz .

A sequência de zíperes de Leu medeia a homo- e/ou heterodimerização das proteínas bZIP, que são conhecidas por se ligarem ao DNA como dímeros . A região do zíper de Leu consiste em heptad repetidas, os aminoácidos são referidos a, b, c, d, e, f, e, g dentro de cada heptad . Como os aminoácidos nas posições a, d, e e e g estão próximos à interface do zíper de Leu, esses aminoácidos são os que determinam principalmente a oligomerização do zíper de Leu, a estabilidade da dimerização e a especificidade da dimerização. Foram analisadas as composições dos aminoácidos encontrados nas posições a, d, e e e g das bZIPs de amendoim (Fig. 4a).

Na posição, cerca de 20% dos resíduos eram asparagina (Asn/N), que pode formar uma bolsa polar na interface hidrofóbica, permitindo interações N-N mais estáveis em a↔a′ (a posição correspondente na hélice oposta), em comparação com outros aminoácidos . Através dos diferentes heptads, o segundo e o quinto heptads tiveram a maior freqüência de resíduos de Asn/N em uma posição (61,46 e 60,22%, respectivamente; Fig. 4b). Na posição d (Fig. 4a), o Leu foi encontrado em 45% de todos os bZIPs de amendoim e é um dos aminoácidos alifáticos mais estabilizadores. Na posição e, 37% de todos os bZIPs de amendoim tinham os aminoácidos ácidos D ou E, enquanto na posição g, 44% de todos os bZIPs de amendoim tinham os aminoácidos básicos R ou K (Fig. 4a). Estes aminoácidos carregados são pensados para formar pontes salinas entre hélices em interacções electrostáticas . As interacções electrostáticas atractivas ou repulsivas g↔e′ também podem formar pontes salinas interelicais que afectam a especificidade e estabilidade da dimerização . Para investigar a contribuição de resíduos carregados nas posições e e e g na regulação das propriedades de dimerização das proteínas Arachis bZIP, foram calculadas as frequências de pares atrativos e repulsivos g↔e′ em cada heptad (Fig. 4c). Em todos os heptads, os pares atrativos g↔e′ foram concentrados nos segundo (15,6%), quinto (35%) e sexto (30%) heptads, indicando que podem formar interações atrativas completas g↔e′ e contribuir para a estabilidade através da complementação em um heterodímero. Três grupos compreendendo 28 subfamílias (BZ1-BZ28) foram ainda divididos com base nas propriedades de homo- e heterodimerização, particularmente a especificidade da dimerização (arquivo adicional 7).

O impacto da duplicação do genoma inteiro e duplicação em tandem na expansão da família do gene Arachis bZIP

Nós identificamos os blocos colineares duplicados em todo o genoma nos genomas A. duranensis e A. ipaensis e os blocos colineares ortológicos entre dois genomas. As distâncias sinônimas em pares (valores Ks) entre os parálogos e ortologs dentro dos blocos colineares foram calculadas, e suas distribuições de freqüência foram plotadas (Fig. 5a; Ks bin = 0,05). A freqüência de pico de Ks entre A. duranensis e A. ipaensis, representando a variação da seqüência média, foi de 0,035. Isto representou a divergência de seqüência entre estas duas espécies de Arachis, que foi estimada em ~ 2,16 milhões de anos atrás. Além disso, os picos de Ks para A. duranensis e A. ipaensis paralogs foram de 0,90 e 0,95, respectivamente, correspondendo à divergência de sequência do evento de duplicação de papilionóides primitivos do genoma inteiro (WGD) ocorreu ~ 58 milhões de anos atrás .

Detemos 35 AdbZIPs e 32 AibZIPs envolvidos em blocos genômicos duplicados, representando cerca de 70% (35/50) e 71% (32/45) dos genes bZIP em cada espécie (Fig. 5b e arquivo adicional 8). Além disso, os pares de genes bZIP duplicados ocorreram dentro de um cromossomo ou entre cromossomos, e alguns destes pares foram segmentarmente duplicados uma, duas ou três vezes. Este resultado indicou retenção preferencial de genes e arranjos cromossômicos freqüentes após a DGA. Duplicações tandem foram detectadas para apenas dois pares de genes (AdbZIP33/AdbZIP34 e AdbZIP41/AdbZIP42) em A. duranensis e apenas um par de genes (AibZIP28/AibZIP29) em A. ipaensis. Isto sugeriu que a duplicação em tandem ocorreu raramente e não foi mais importante que a duplicação segmentar na expansão da família do gene bZIP. Também usamos análises filogenéticas e sintéticas para identificar 35 pares de genes ortológicos bZIP entre A. duranensis e A. ipaensis. Estes genes também foram homeólogos entre os dois subgêneros do amendoim tetraplóide.

Para entender as restrições evolutivas atuando sobre os genes Arachis bZIP, calculamos valores Ka/Ks para cada par de genes bZIP duplicados em duas espécies Arachis (arquivo adicional 9). Para a maioria destas comparações de pares, os valores Ka/Ks foram inferiores a 0,5 (apenas uma comparação de pares entre AdbZIPs duplicados e apenas duas entre AibZIPs duplicados foram maiores que 0,5). Isto sugeriu que uma forte seleção purificadora atuou sobre os bZIPs Arachis duplicados para remover mutações deletérias ao nível da proteína.

Análise de expressão dos genes bZIP Arachis durante o desenvolvimento da semente de amendoim

Para perfilar a expressão do gene bZIP, utilizamos nossos dados RNA-seq previamente publicados , que documentam a expressão gênica em sementes de amendoim em diferentes estágios de desenvolvimento: 20, 40, e 60 dias após a floração (DAF). Usando esses dados, identificamos os valores de FPKM para todos os bZIPs Arachis e todos os bZIPs expressos diferentemente ao longo dos três estágios de desenvolvimento. Com exceção de 24 bZIPs, que não foram expressos em nenhum estágio de desenvolvimento, foram reconhecidos quatro grupos incluindo os genes bZIP correspondentes com perfil de expressão específico(Fig. 6a e arquivo adicional 10). O primeiro grupo era composto de 37 bZIPs que foram up-regulated durante o desenvolvimento inicial (20 DAF), mas down-regulated depois (em 40 e 60 DAF). O segundo grupo era composto de 15 bZIPs que estavam em alta a 40 DAF, enquanto o terceiro grupo era composto de 17 bZIPs que estavam em baixa a 40 DAF. O quarto grupo era composto por 22 bZIPs que foram altamente expressos em todas as três fases de desenvolvimento. As bZIPs altamente expressas no grupo quatro foram distribuídas principalmente nos clades A, C e S. Várias dessas bZIPs foram homólogas a genes que foram implicados no desenvolvimento de sementes em outras plantas, tais como Arabidopsis, arroz e milho. Aqui, 12 bZIPs, que foram altamente expressos e homólogos a genes bem estudados anteriormente no desenvolvimento de sementes, foram selecionados para confirmação qRT-PCR, e descobriram que os padrões de expressão determinados pelo RNA-seq foram consistentes com aqueles encontrados usando qRT-PCR (Fig. 6b).

No grupo A, AdbZIP33 e AibZIP28 foram ortológicos para Arabidopsis ABA insensitive 5 (ABI5), que está associado à sinalização ABA assim como a regulação do desenvolvimento de sementes e longevidade em Arabidopsis e leguminosas . Nossos resultados RNA-seq e qRT-PCR mostraram que ambas as cópias ortológicas do ABI5 dos dois subgêneros do amendoim tetraplóide foram altamente expressas durante o desenvolvimento, sugerindo que a função destes genes pode ser similar no amendoim e na Arabidopsis. Nossos resultados do qRT-PCR também indicaram que os genes do grupo A AdbZIP42, AdbZIP48 e AibZIP31 foram estavelmente expressos durante o desenvolvimento (Fig. 6b e arquivo adicional 11). Estes genes são homólogos aos ABFs e AREB, que estão envolvidos no desenvolvimento de sementes mediadas por ABA, germinação e maturação embrionária . Três genes do grupo C (AdbZIP23, AdbZIP37, e AibZIP30) também foram altamente expressos, e são homólogos ao fator bZIP do milho Opaque2. Opaque2 regula a acumulação de proteínas e o metabolismo de aminoácidos e açúcares nas sementes de milho . Além disso, os genes do grupo S AibZIP10, AdbZIP12, AdbZIP24, AdbZIP26, e AdbZIP36 foram extremamente expressos em sementes de amendoim (Fig. 6b e arquivo adicional 11). Curiosamente, os genes do grupo S AdbZIP24 e AdbZIP36 tinham um padrão de expressão similar aos genes do grupo C AdbZIP37 e AibZIP30: uma diminuição no nível de expressão à medida que o desenvolvimento da semente progredia.

Em seguida, investigamos mais profundamente as divergências na expressão gênica entre os genes homeólogos dos genomas AA e BB do amendoim tetraplóide. A análise do heatmap indicou que os padrões gerais de expressão no desenvolvimento de sementes foram semelhantes para 31 pares de genes homeólogos/ortológicos dos genomas AA e BB. Utilizamos o método de análise de expressão diferencial em combinação com métodos estatísticos para calcular as diferenças na expressão gênica entre esses pares de genes para cada amostra. Verificamos que 3 pares de genes (AdbZIP5 e AibZIP5, AdbZIP17 e AibZIP15, AdbZIP46 e AibZIP41) foram expressos diferentemente em 20 DAF, 3 pares (AdbZIP3 e AibZIP1, AdbZIP4 e AibZIP4, AdbZIP49 e AibZIP45) em 40 DAF, e 5 pares (AdbZIP3 e AibZIP1, AdbZIP33 e AibZIP28, AdbZIP37 e AibZIP30, AdbZIP10 e AibZIP10, AdbZIP1 e AibZIP3) em 60 DAF. Estes resultados indicaram a conservação da expressão global entre dois genomas, mas sugeriram que 20% dos genes divergiram na expressão durante a evolução paralela e a polipoidização de dois genomas (Fig. 6c).

qRT-PCR perfis de expressão dos genes Arachis bZIP sob tensão salina

Usamos qRT-PCR para explorar mudanças na expressão do gene bZIP em resposta ao tratamento com sal (Fig. 7 e arquivo adicional 12). Não fomos capazes de amplificar claramente 4 bZIPs com PCR. Após 1 h de tratamento com sal das raízes de amendoim, 20 genes foram significativamente expressos de forma diferente; após 5 h, 27 genes foram significativamente expressos de forma diferente; e após 10 h, 41 genes foram significativamente expressos de forma diferente (Fig. 7j; Teste t de Student: P < 0,05). Em cada momento, muito mais genes foram regulados para cima do que para baixo (14 vs. 6 a 1 h; 21 vs. 6 a 5 h; e 34 vs. 7 a 10 h). Dentre estes bZIPs, expressos diferentemente após o tratamento com sal, muitos deles foram distribuídos nos grupos A e S (Fig. 7k), indicando que os bZIPs nestes grupos desempenham papéis importantes na sinalização do açúcar e na regulação do estresse abiótico.