Em humanos, aproximadamente 5 a 8 litros de ar passam para dentro e para fora do pulmão por minuto quando em repouso. O ar pode variar na concentração de oxigênio e CO2, pode transportar alergênios e confere diferentes extensões de extensão mecânica das vias aéreas e das superfícies de troca de gases. Esses sinais são detectados, retransmitidos e processados em saídas fisiológicas como o controle da pressão arterial pulmonar, respostas imunológicas e ritmo respiratório, mas o mecanismo não é claro. As células neuroendócrinas pulmonares (PNECs) são encontradas em uma ampla gama de organismos, desde peixes até mamíferos (1). No pulmão dos mamíferos, as PNECs são as únicas células epiteliais das vias aéreas interiores e representam menos de 1% da população total de células epiteliais pulmonares (2). Embora evidências in vitro tenham implicado PNECs na detecção de oxigênio, tônus muscular liso brônquico e vascular e respostas imunológicas (1, 3), esses papéis não foram demonstrados in vivo. Um estudo recente mostrou que a ablação genética das PNECs no adulto não comprometeu a homeostase ou a reparação das vias aéreas, deixando em questão a importância in vivo dessas células (4). Patologias PNEC, em particular um aumento no número de PNEC, foram documentadas em uma grande variedade de doenças pulmonares, incluindo asma, displasia broncopulmonar, fibrose cística, doença pulmonar obstrutiva crônica, hérnia diafragmática congênita, hiperplasia neuroendócrina da infância, síndrome da morte súbita infantil e hipertensão pulmonar (5-8). Em cada caso, não fica claro se o aumento da CSEP é uma causa ou consequência de sintomas.

No pulmão de camundongo, a maioria das CSEPs reside em grupos de ~3 a 20 células chamadas corpos neuroepiteliais (NBE) (3, 9). Tanto os PNECs solitários quanto os agrupados contêm vesículas de núcleo denso, preenchidas com neuropeptídeos bioativos como o peptídeo relacionado ao gênero calcitonina (CGRP) ou aminas como a serotonina (1). Estes são liberados em resposta a estímulos, tais como mudanças no nível de oxigênio. Neuropeptídeos e aminas têm sido implicados em alguns dos mesmos processos que as PNECs (10-12), levantando a possibilidade de que eles possam mediar a função PNEC. Entretanto, um elo causal não foi demonstrado in vivo.

Iniciamos o presente estudo para descobrir os mecanismos subjacentes à hérnia diafragmática congênita (HDC), um defeito de nascença associado a considerável disfunção pulmonar, incluindo resposta imune aumentada e hipertensão pulmonar (13). Em um modelo de hérnia diafragmática congênita (HDC), descobrimos um defeito de agrupamento PNEC falhado. Isto é seguido por uma sequência de eventos: um aumento dos neuropeptídeos PNEC, um aumento dos infiltrados imunológicos e uma remodelação da estrutura pulmonar. Estes achados oferecem uma demonstração in vivo da função da CSEP. Como mudanças no número de PNEC e neuropeptídeos associados têm sido documentadas em muitas doenças pulmonares, nossos resultados têm amplas implicações além do CDH.

Em humanos, mutações nos genes do receptor de rotunda (ROBO) têm sido associadas ao CDH (13, 14). Para estudar os defeitos pulmonares associados ao CDH, inativamos tanto Robo1 quanto Robo2 em epitélio derivado do endoderme, incluindo o pulmão, usando o Shhcre (daqui por diante Shhcre;Robo mutante) em camundongos (15, 16). Embora estes mutantes sobrevivam, eles exibem área de superfície de troca gasosa reduzida a partir do dia pós-natal (P) 15 (Fig. 1, A e B, e fig. S1). Realizamos microarranjo seguido de transcriptase quantitativa inversa de reação em cadeia da polimerase (qRT-PCR) em P7, antes da redução da superfície de troca gasosa. Quinze dos 20 genes mais importantes foram implicados em respostas imunes e todos estão significativamente aumentados, incluindo Ccl3, Cxcl2, Tnfa, e Saa3 (Fig. 1C). Consistente com esta assinatura, observamos números elevados de células imunológicas, incluindo neutrófilos, eosinófilos, macrófagos e células T (Fig. 1, D e E, e fig. S2). Além disso, há um aumento na proporção de M2 e uma diminuição na proporção de macrófagos M1 (fig. S3). Estes achados indicam que o Shhcre;mutantes Robo mostram uma sensibilidade imunológica elevada, imitando uma comorbidade CDH comum (13).

Embora Robo seja expresso na região alveolar do mesênquima pulmonar (fig. S4), sua expressão no epitélio é restrita a células raras ao longo das vias aéreas (fig. 1F). A coloração com anticorpos CGRP revelou que as células epiteliais Robo-expressoras são PNECs (Fig. 1G). Para confirmar que os genes do Robo são necessários dentro das PNECs para sua função, inativamos o Robo usando Ascl1creERT2 (17), um gerador de cremes que confere atividade específica ao PNEC no epitélio pulmonar (Fig. S5). Verificamos que Ascl1creERT2; mutantes Robo exibiram simplificação alveolar e aumento de macrófagos, recapitulando os fenótipos Shhcre;Robo (fig. S6). Esses achados juntos demonstram que o Robo é necessário especificamente nos PNECs para restringir o número de células imunes e prevenir a simplificação alveolar.

No dia embrionário (E) 13,5, os PNECs recentemente especificados eram células solitárias tanto no controle quanto no Shhcre;Pulmões mutantes Robo (Fig. 2, A e B). Por E15,5, a maioria dos PNECs tinham se agregado em NEBs no controle. Entretanto, as PNECs não foram agregadas em Shhcre;Robo mutantes (Fig. 2, C e D). Este fenótipo altamente penetrante persistiu nos pulmões pós-natais (Fig. 2, E e F, e fig. S7). O número total de células PNEC parece não ser afetado, como suportado pela expressão normal de Ascl1 e outros marcadores PNEC (fig. S8). As células não incluídas no mutante perdem sua forma de cunha e são mais arredondadas (figs. S7 e S9). Além disso, ao contrário dos controles, onde as CSEPs solitárias não são infundidas (9), ~33,3% (31 de 93 células) das CSEPs não incluídas são infundidas no mutante (Fig. 2F e Fig. 2F). S9), sugerindo que a inervação da CSEP não depende da formação de aglomerados ou da função do Robo em CSEPs.

Ascl1creERT2; Os mutantes Robo também exibem PNEC desclassificados (fig. S10). Este fenótipo manifestou-se mesmo quando a inativação do Robo foi induzida postnatalmente, o que é posterior à formação da NBE. Juntos, nossos resultados estabelecem que o Robo é necessário para a montagem e manutenção do PNEC em NEBs.

Robo pode funcionar de forma dependente ou independente do seu ligante, Slit (18). A análise dos mutantes em Slit mostra que, enquanto o agrupamento PNEC não é afetado em nenhum dos mutantes individuais, ele é reduzido em Slit1;3 mutantes (fig. S11, A a D). Este resultado sugere que a função Robo neste processo é provavelmente dependente de ligantes.

Slit e a função Robo principalmente para mediar a repulsão celular e raramente a atração (19). Para determinar se Slit age como um sinal repulsivo ou atrativo para PNECs Robo-expressores, nós primeiro determinamos onde os genes de Slit são expressos. O repórter da Slit1;2-GFP (proteína fluorescente verde) revelou expressão em apenas cerca de 1 a 3 PNECs dentro de grandes NEBs, levantando a possibilidade de que as células de Slit1/2-expressoras possam ser as células nucleadoras do aglomerado (fig. S11E). Isto também indica a sub-especialização PNEC dentro de um cluster. A expressão da Slit3 é restrita à camada de células lisas-músculo vascular que envolve as artérias, que corre ao longo dos brônquios principais onde se encontra a maioria das células NEBs (fig. S11, F e G). Juntas, a proximidade próxima de células Slit-expressoras às PNECs Robo-expressoras levantou a possibilidade de que os ligandos Slit possam fornecer uma taco atraente para PNECs.

Para testar isso, citometria de fluxo classificada GAD1-GFP+ PNECs foram semeadas na câmara superior de uma inserção de cultura de migração celular de Boyden. Quando a proteína Slit foi adicionada com as células na câmara superior, ~52% menos (P = 8,5 × 10-4) PNECs migraram para a parte inferior (fig. S12, J para I). Ao contrário, quando a proteína Slit foi adicionada à câmara inferior, 18% mais (P = 7,5 × 10-5) PNECs migraram para a câmara inferior (fig. S11, L para N). Estes resultados sugerem que o Slit-Robo impulsiona o agrupamento de PNECs em NEBs, provavelmente através de atração celular.

Para testar uma possível ligação entre PNECs e resposta imune, nós testamos a expressão de neuropeptídeos produzidos por PNECs (1). Dos nove genes de neuropeptídeos testados, cinco foram significativamente aumentados no Shhcre; mutantes robóticos (Fig. 3A). A coloração com anticorpos contra CGRP revelou que, apesar de sua expressão permanecer em PNECs no mutante, a intensidade da coloração está aumentada e não mais restrita ao lado basal dessas células (figs. S7 e S9). Observamos também que, embora a desinclusão tenha ocorrido por E15,5, a up-regulation dos neuropeptídeos só é observada após o nascimento, presumivelmente por exposição ao ar (fig. S12).

Para determinar se o aumento dos neuropeptídeos contribui para a resposta imune, focalizamos a PCRGC porque sua transcrição mostra o maior aumento entre todos os ensaios (fig. 3A). Combatemos este aumento criando um alelo mutante de Cgrp dentro do Shhcre;Robo background (20). Nos controles Robo, a perda de Cgrp não alterou o número de macrófagos (Fig. 3, B, D, e F). No entanto, no Shhcre;Robo mutantes, a perda de Cgrp diminuiu significativamente os números de macrófagos de forma dose-dependente (Fig. 3, C, E, e F). Verificamos também que a perda de Cgrp reverteu parcialmente o fenótipo de simplificação alveolar (Fig. S13). Observamos que nem o aumento de macrófagos nem a simplificação alveolar foram totalmente evitados, sugerindo que o aumento de outros neuropeptídeos pode contribuir para os resultados a jusante. Juntos, esses resultados fornecem demonstração genética in vivo de que os neuropeptídeos medeiam a função PNEC.

Como a alveólenese normal se inicia em P4 (21), o aparecimento tardio da simplificação alveolar em P15 sugere que a ruptura da alveólenese pode não ser uma causa primária. Embora nenhuma alteração na morte celular tenha sido observada pelo P10, houve uma clara redução da elastina (fig. S14), o que é um possível desencadeador da simplificação (22). Células imunes como as metaloproteinases de matriz expressa de macrófagos que degradam a elastina (23). Além disso, o aumento dos macrófagos é observado antes da simplificação (figs. S1 e S2), levantando a possibilidade de uma relação causal. Para testar isso, tratamos o Shhcre;Robo e controle pulmonar com clodronato, uma droga hidrofílica que esgota os macrófagos (24). O tratamento a partir do P5, antes do aumento da célula imune, restringiu efetivamente o número de macrófagos alveolares ao nível da linha de base no Shhcre;Robo mutantes (Fig. 4, A a E). Isto atenuou a diminuição da elastina e impediu completamente a simplificação (Fig. 4, F a J, e fig. S15). Juntos esses dados oferecem demonstração in vivo de que o aumento dos infiltrados imunes é responsável pela simplificação alveolar e que ambos são conseqüências a jusante da disfunção PNEC.

Neste estudo, apresentamos evidências genéticas in vivo demonstrando que as PNECs, apesar de sua raridade, têm profundo impacto na função pulmonar pós-natal. Embora o defeito PNEC já seja evidente no E15,5 no Shhcre;Robo mutante, os resultados fisiológicos, começando com a up-regulation dos neuropeptídeos, iniciam-se após o nascimento. Isto sugere que o efeito da CSEP é dependente da exposição pulmonar ao ar. Assim, nossos achados delineiam um modo de transdução de sinal no qual PNECs são reostatos sensíveis na parede da via aérea que traduzem sinais ambientais não-celulares de forma não-autônoma em respostas imunológicas.

Nossos resultados estabelecem o Robo1,2 como um conjunto de genes que controlam o agrupamento de PNECs em NEBs. Ele também apresenta Slit e Robo como jogadores na classificação seletiva de células no epitélio de um órgão de um mamífero. A inativação do Robo após a formação da NBE também levou à desclassificação, sugerindo que os aglomerados são mantidos ativamente. Embora o Slit-Robo seja amplamente conhecido por mediar a repulsão celular, nossos dados indicam que eles impulsionam a aglomeração PNEC através da atração celular. A inativação por robô levou à alteração da inervação e perda da localização dos neuropeptídeos basal. Essas alterações podem estar subjacentes ao impacto alterado das PNECs.

Foi documentado um aumento no número de PNECs em uma grande variedade de doenças associadas ao fungo, variando de doenças raras como a CDH a doenças comuns como a asma (5-8). Observamos que o fenótipo PNEC mutante Robo é distinto do aumento do número de PNEC. No entanto, ambos estão associados a neuropeptídeos aumentados, os quais mostramos ser potentes efetores da função PNEC. Nossos achados predizem assim que, ao invés de serem uma leitura passiva da doença, as patologias PNEC documentadas e os aumentos de neuropéptidos podem servir como contribuintes ativos para os sintomas de uma grande variedade de doenças respiratórias.