Bonellia albiflora: Uma planta medicinal maia que induz apoptose em células cancerosas
Abstract
Poucos estudos foram feitos sobre a flora médica da Península de Yucatan do México em busca de novos agentes terapêuticos, em particular contra o cancro. Neste trabalho, avaliamos o potencial citotóxico do extrato de Bonellia albiflora, uma planta utilizada na medicina tradicional maia para o tratamento de lesões crônicas da boca. Realizamos os extratos metanólicos de diferentes partes da planta por meio de extração com o equipamento Soxhlet. Realizamos frações líquido-líquido em cada extrato com solventes de polaridade crescente. Todos os extratos e frações foram avaliados para atividade citotóxica versus quatro linhas de células cancerígenas humanas e uma linha de células normais através de um ensaio de tetrazolium dye reduction (MTT) em placas de cultura celular de 96 poços. O extrato de raiz de citotoxicidade do metanol possuía atividade citotóxica muito maior na linha celular orofaríngea humana (KB); sua fração hexânica concentrou os metabólitos ativos e induziu apoptose com a ativação das caspases 3 e 8. Os resultados demonstram o potencial citotóxico da fração hexânica da B. albiflora e substanciam a importância do estudo das plantas medicinais maias tradicionais.
1. Introdução
A medicina tradicional é uma prática que tem sido realizada desde a antiguidade até o nosso tempo por habitantes dos pueblos indígenas do México, entre os quais a população maia da Península de Yucatan no México está incluída. Na medicina tradicional maia, as plantas são de grande importância, o que pode ser considerado como prova de sua eficácia para o controle de muitos tipos de doenças. Do mesmo modo, elas constituem uma das alternativas mais importantes para o cuidado da saúde, sobretudo em comunidades onde os serviços primários de saúde não são acessíveis. Além disso, podem ser aproveitadas amplamente como um recurso natural renovável. Juntamente com o descrito anteriormente, a medicina tradicional dos pueblos indígenas foi reconhecida pela Organização Mundial da Saúde (OMS), o que provocou um poderoso impulso para a pesquisa de plantas medicinais.
A literatura etnobotânica maia na sua maioria é composta por estudos históricos ou descritivos, em cujo conteúdo predomina um compêndio de doenças e tratamentos conhecidos pelos curandeiros maias de épocas distintas . Os maias conheciam e tratavam doenças distintas, incluindo as de origem infecciosa (infecções intestinais, dermatites infecciosas e infecções respiratórias), doenças crônicas (asma, fadiga, nefrite e hipertensão) e doenças do tipo psicológico (insônia, nervosismo e histeria). Além disso, curaram outras doenças como: abcessos; calos; calos, protuberâncias duras; pólipos; tumores; e verrugas ou feridas, geralmente tangíveis ou visíveis na pele .
Na medicina tradicional maia da Península de Yucatan, “câncer” é conhecido como uma doença ou um conjunto de doenças que podem se manifestar como uma afetação da pele ou massa muscular subadjacente, ou uma afetação sob a forma de dor em algum órgão interno. O termo alude a uma doença de cura difícil ou com um aspecto desagradável (quando afeta a pele); se for um câncer interno, a aparência do paciente revela a doença. Os antigos habitantes atribuíram nomes na língua maia a este conjunto de sintomas; na língua maia, “câncer” é conhecido como “tsunuz” ou “tsunuztacan”, e protuberâncias duras ou tumores são conhecidos como “chu’uchum” .
Estudos preliminares demonstraram que os extratos de plantas utilizados na medicina tradicional maia para o tratamento dos sinais e sintomas sugestivos de câncer possuem atividade citotóxica . Similarmente, dois estudos realizados em duas espécies do gênero Bonellia (Bonellia macrocarpa e Bonellia flammea) da Península de Yucatan revelam a presença de novos compostos, como agentes ativos com atividade anticarcinogênica . Neste contexto, a Península de Yucatan tem cinco espécies do gênero Bonellia, entre as quais as espécies B. macrocarpa, B. flammea e B. albiflora são empregadas na medicina tradicional maia para o tratamento das afecções do tipo dermatológico. Destas três espécies, apenas a B. albiflora não foi objeto de nenhum estudo fitoquímico ou de atividade biológica. A B. albiflora é denominada “Si’ik” na medicina tradicional Maia e é usada como antitusiva para o tratamento de feridas de pele e boca e para aliviar dores de dentes. Neste trabalho, propomos uma avaliação do potencial citotóxico dos extratos orgânicos de B. albiflora.
2. Materiais e Métodos
2.1. Material Vegetal
Bonellia albiflora (Lundell) B. Ståhl e Källersjö foi coletado de diferentes Localidades do Estado de Yucatan, México, durante o verão de 2010. O material vegetal foi identificado e autenticado por taxonomistas do Departamento de Recursos Naturais do Centro de Pesquisa Científica de Yucatan (CICY).
2.2. Produtos químicos
Medio Eagle modificado (DMEM) da Dulbecco, soro fetal bovino ativado por calor (FBS), e penicilina e estreptomicina (PS) foram adquiridos de Gibco, Carlsbad, CA, EUA. O brometo de 3(4-5-dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil tetrazólio (MTT), dimetil sulfóxido (DMSO) e etoposídeo foram comprados de Sigma, St. Louis, MO, EUA. Os kits de ensaio Caspase e o kit de dosagem de DNA apoptótico foram adquiridos da BioVision Research Products, Palo Alto, CA, EUA.
2.3. Extração e Fracionamento
Cada parte vegetal foi separada, seca, e pulverizada. O pó seco do material vegetal separado (100 g) foi exaustivamente extraído usando um aparelho Soxhlet a 60°C de temperatura com metanol (500 mL). Os sobrenadantes foram filtrados e evaporados sob vácuo por meio de um rotaevaporador para obter um extrato seco. O extrato de metanol de cada material vegetal (10 mg) foi suspenso em 20 mL de metanol: água (1 : 3) e extraído sucessivamente usando 50 mL de solventes de polaridade crescente: hexano, diclorometano e acetato de etila, de tal forma que o extrato do resíduo final foi uma fração aquosa. A impressão digital do extrato ativo de hexano (5 mg) foi obtida para cromatografia gasosa espectrometria de massa (GC-MS).
2.4. Linhas Celulares e Cultura
Linhas celulares do carcinoma orofaríngeo (KB ATCC-CCL-17), carcinoma laríngeo (Hep-2), adenocarcinoma do colo uterino (HeLa ATCC-CCL-2), e carcinoma escamoso do colo uterino (SiHa ATCC-CCL-35), bem como uma linha celular normal, rim de célula canina (MDCK ATCC-CCL-34), da American Type Culture Collection (ATCC) foram gentilmente cedidos por Veronica Vallejo-Ruíz do East Biomedical Research Center-IMSS. As células foram cultivadas em meio DMEM, contendo 10% SFB suplementado com 100 unidades/mL de penicilina G e 100 μg/mL de estreptomicina em 5% de CO2-95% de ar umidificado a 37°C.
2,5. Ensaio de Citotoxicidade
A citotoxicidade foi determinada pelo ensaio MTT de acordo com o método descrito por Denizot e Lang com algumas modificações. Resumidamente, células viáveis de cada linha celular foram semeadas em uma placa de 96 poços e incubadas por 24-48 h. Quando as células atingiram >70% de confluência, o meio foi substituído e as células foram tratadas com o extrato dissolvido em DMSO (concentração máxima de 0,05%) a 2,34 a 300 g/mL. Após 48 h de incubação, 10 μL MTT (5 mg/mL) foi adicionado a cada poço e incubado a 37°C durante 4 h. O meio foi retirado e o precipitado de formazan foi dissolvido em 100 μL de isopropanol acidificado (HCl 0,4 N). A densidade óptica foi determinada com um espectrofotômetro a 540 nm. As células tratadas com DMSO 0,05% e docetaxel foram utilizadas como controles negativos e positivos, respectivamente. A concentração do extrato que matou 50% das células (CC50) foi calculada pelo software GraphPad Prism 4.00. Todas as determinações foram realizadas em triplicata. A linha de células do MDCK foi utilizada para avaliar o índice seletivo (SI) dos extratos. O SI é definido como a razão de atividade citotóxica das linhas de células normais e cancerígenas.
2,6. Análise GC-MS
A separação cromatográfica foi realizada pela análise GC-MS em um cromatógrafo de gás Agilent, modelo 6890N, acoplado a um detector seletivo de massa, modelo 5975B. Os compostos foram separados em uma coluna capilar DB-5 ms (30 m × 0,32 mm i.d., 0,25 μm espessura do filme) (J&W Scientific, Folsom, CA, EUA). Um microlitro da amostra foi injetado no GC-MS usando o modo split (50 : 1). A temperatura do injector foi de 250°C. A temperatura da coluna foi programada da seguinte forma: temperatura inicial a 160°C durante 3 min, 10°C/min a 240°C, 240°C durante 2 min, 5°C/min a 250°C, 250°C durante 10 min, 5°C/min a 300°C, e 300°C durante 10 min. As condições do detector de massa foram as seguintes: modo de impacto eletrônico (EI) a 70 eV; temperatura da fonte: 230°C; taxa de varredura: 1 varredura/s; faixa de aquisição de massa: 20-600 amu; retardo de solvente, 4 min. O gás portador era hélio a 1 mL/min. Componentes voláteis foram provisoriamente identificados através da comparação de seus espectros de massa usando o banco de dados de referência padrão NIST Versão NIST 05 para Windows. Um padrão autêntico de composto bonediol foi gentilmente fornecido pelo Dr. Peraza-Sánchez do CICY.
2.7. Análise de fragmentação de DNA
DNA fragmentação foi determinada de acordo com o método descrito por Tong et al. . Em resumo, as células foram tratadas com o extrato em 10 e 50 μg/mL e incubadas por 6, 12 e 24 h. Após a incubação, as células foram colhidas por centrifugação e lavadas duas vezes em PBS gelada. Um kit de escada de DNA apoptótico (BioVision apoptotic DNA laddering kit) foi utilizado para isolar o DNA de acordo com o protocolo do fabricante; o DNA nas amostras foi separado em gel de agarose a 1,5% contendo 1 μg/mL de brometo de etídeo. As bandas de DNA foram visualizadas sob iluminação ultravioleta e foram fotografadas.
2,8. Ensaios das Atividades Caspases
Caspases 3, 8, e 9 atividades foram realizadas utilizando o kit de ensaios colorimétricos FLICE/Caspase, seguindo os protocolos do fabricante. Em resumo, células tratadas com 10 ou 50 μg/mL de extrato por 6, 12 ou 24 h foram colhidas, lavadas com PBS e centrifugadas a 800 ×g por 10 min a 4°C. As pastilhas de células foram ressuspendidas em 50 μL lise tampão e incubadas em gelo durante 10 min antes de serem centrifugadas a 10.000 ×g durante 1 min. O sobrenadante foi coletado em um tubo de 1,5 mL e mantido em gelo. Após a medição da concentração proteica, 200 μg de proteína foram dissolvidos em 50 μL tampão de lise celular. O tampão de reacção com 10 mM de DDT foi adicionado a cada amostra. Finalmente, um substrato específico para cada caspase (DEVD-ρNA, IETD-ρNA e LEHD-ρNA) foi adicionado às amostras, incubado a 37°C durante 1 h, e lido a 405 nm. A atividade enzimática foi expressa como dobra sobre a amostra controle.
3. Resultados e Discussão
3.1. Atividade citotóxica dos extratos metanólicos
Os resultados da citotoxicidade dos extratos metanólicos de diferentes partes de B. albiflora estão resumidos na Tabela 1. O extrato metanólico da casca da raiz mostrou a atividade citotóxica mais interessante em comparação com extratos de folhas e casca de caule de B. albiflora, com um CC50 de 12-31 μg/mL nas quatro linhas de células cancerígenas humanas. A linha celular KB mostrou uma maior sensibilidade ao extrato com um CC50 de 12,64 μg/mL. A linha de células renais não tumorais MDCK foi menos sensível aos efeitos do extrato com um SI de >5 nas linhas de células avaliadas (Tabela 1). O US National Cancer Institute (NCI) propôs que extratos crus com atividade citotóxica potencial são aqueles que apresentam um CC50 de ≤30 μg/mL; assim, este extrato foi identificado como importante para estudos futuros. Estes dados são semelhantes aos obtidos nos extratos ativos de B. macrocarpa-root metanolic em linhas de células humanas: KB, adenocarcinoma de próstata (PC3), carcinoma escamoso do colo uterino (SiHa), adenocarcinoma de mama (MCF-7), adenocarcinoma do colo uterino (HeLa) e carcinoma laríngeo (Hep-2) .
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| NA: sem atividade > 200 μg/mL. | |||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
O extrato de folhas foi o segundo em maior atividade, somente na linha celular KB com um CC50 de 23.85 μg/mL de acordo com os critérios NCI, seguido pelo do extrato de casca de caule, que era menos citotóxico para as linhas de células KB e Hep-2.
3.2. Atividade citotóxica das frações
Os extratos metanólicos de diferentes partes da planta foram fracionados com solventes de polaridade crescente para estudos posteriores de citotoxicidade nas linhas de células. A fração hexânica obtida a partir da partição líquido-líquido do extrato metanólico da casca da raiz (HFBa) apresentou efeitos citotóxicos superiores aos do extrato original, com um CC50 entre 2 e 27 μg/mL nas distintas linhas celulares (Tabela 2). O SI da fração hexânica também melhorou em relação ao extrato original nas linhas de células avaliadas (SI = 5-54). As frações metanólicas dos extratos de casca e folhas não foram ativas em concentrações de >200 μg/mL (dados não mostrados).
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| NA: sem atividade > 200 μg/mL. | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
Anteriormente, realizamos um estudo bioguiado para avaliar a atividade antiproliferativa de B. macrocarpa, produzindo o isolamento do composto bonediol, que mostrou atividade moderada nas linhas celulares cancerígenas . Entretanto, o presente estudo não mostrou efeitos citotóxicos com HFBa comparáveis ao extrato metanólico original nas linhas celulares avaliadas (Tabela 2). Uma explicação para estes resultados pode ser que o bonediol inibe algum ponto de proliferação celular (ciclo celular ou replicação do DNA), enquanto os efeitos observados no ensaio citotóxico são danos ou toxicidade geral (apoptose ou necrose) .
HFBa apresentou melhores efeitos citotóxicos em comparação ao bonediol e foi mais seletivo em relação ao tumor do que em relação às células normais; a SI é considerada um indicador de atividade biológica e não está relacionada à citotoxicidade se a SI for >10 . Neste sentido, apenas a HFBa satisfez estes critérios e foi mais potente na linha celular KB com um CC50 de 2,73 μg/mL; esta linha celular está relacionada ao câncer oral e está de acordo com o uso da planta na medicina tradicional Maia para lesões orais crônicas, termo que poderia estar relacionado com o câncer.
3,3. Análise GC-MS
Identificação e análise química da fração hexana bioativa pelo GC-MS é apresentada na Tabela 3. O cromatograma revelou um total de oito picos, dos quais seis foram identificados pelo banco de dados: ácido dodecanóico; ácido tridecanóico; ácido 2-nonil-malônico, éster dimetílico; estigmasta-7,16-dien-3-ol; 9,19-Cyclo-lanost-24-en-3-ol; e bonediol. Este último foi identificado pelo tempo de retenção e comparação do espectro de massa de um padrão autêntico previamente isolado de B. macrocarpa . Os principais componentes encontrados foram os seguintes: ácido 2-nonil-malônico, éster dimetílico (37,39%), seguido por estigmasta-7,16-dien-3-ol (13,63%), ácido dodecanóico (13,22%), 9,19-Ciclo-lanost-24-en-3-ol (9,90%) e bonediol (8,98%). Componentes não identificados com tempos de retenção de 8.092 (6,22%) e 14.207 (5,38%), assim como o ácido n-tridecanóico (5,25%), foram compostos menores no HFBa (Figura 1).
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Bonediol foi isolado do extrato metanólico de raízes de B. macrocarpa como um componente bioativo. Neste trabalho, detectamos a presença deste composto em baixa concentração; assim, ele poderia ser referido como um possível marcador quimiotaxonômico. Adicionalmente, em outras espécies como B. pungens, um triterpeno foi isolado, e de B. ruscifolia, dois triterpenos foram isolados, sem relatos de atividade biológica. Neste trabalho, encontramos apenas evidências da presença de um triterpeno derivado do lanosterol na fração hexânica ativa. Além disso, detectamos um esterol ubiquitinado, um derivado do estigmasterol. Para nosso conhecimento, esta é a primeira vez que ambos os compostos foram relatados neste gênero.
Nos últimos anos, não só o estudo de compostos medicamente bioativos de plantas se tornou mais freqüente, mas também o dos próprios extratos de plantas ou da mistura de compostos que juntos poderiam produzir melhor atividade biológica do que aquela exibida por um único composto se tornou, além disso, freqüente . Neste trabalho, os componentes são descritos como a impressão digital de HFBa realizada pela GC-MS para futuras padronizações.
3.4. Fragmentação de DNA
Observamos que o extrato de metanol das raízes de B. albiflora mostrou morfologia típica da apoptose (dados não mostrados) nas linhas celulares de KB. Similarmente, HFBa foi mostrado para induzir morfologia apoptótica em linhas de células KB. Esses resultados nos levaram a avaliar se a fração hexânica que demonstrou a maior citotoxicidade e características morfológicas da apoptose na linha de células KB poderia induzir esse processo; assim, avaliamos a fragmentação do DNA, típica do processo de apoptose. A fragmentação de DNA foi registrada de menor a maior magnitude dentro de uma faixa de concentração do tratamento de 10 ou 50 μg/mL e uma faixa de tempo de incubação de 6-24 h. A Figura 2 mostra a fragmentação típica de DNA em células KB após o tratamento com 50 μg/mL HFBa e um período de incubação de 18 h. Vários estudos mostraram o efeito apoptótico de certos extratos metanólicos de plantas. Contudo, poucos estudos investigaram as características químicas dos compostos que podem possuir esta actividade. Nesses poucos estudos, verificou-se geralmente que as frações orgânicas de baixa polaridade são responsáveis pelo efeito apoptótico sobre as linhas celulares, coincidindo com os resultados obtidos neste estudo .
Efeito do extrato de raiz de hexano Bonellia macrocarpa na fragmentação do DNA em células KB. Após o tratamento das células com uma concentração de 50 μg/mL de B. macrocarpa durante 12 h, o DNA foi isolado e separado em gel de agarose a 1,5%. O DNA foi corado com brometo de etídeo e visualizado sob luz UV. Pistas 1 a 4: pista 1 (controle negativo): ADN recolhido de células KB não tratadas após 18 h; pista 2 (controlo positivo): ADN recolhido de células KB tratadas com 50 μg/mL de etoposido após 18 h; pista 3: ADN recolhido de células KB tratadas com 50 μg/mL de extracto depois das 18 h; pista 4: DNA marcador de peso molecular.
Não se sabe se os compostos em HFBa são responsáveis pela indução da apoptose, mas não pode ser atribuído a um único composto como o bonediol que, embora presente no extrato, requer altas concentrações para induzir a apoptose (dados não mostrados), ao contrário do HFBa, que induz a fragmentação do DNA em 10 μg/mL. Em relação ao acima exposto, além do bonediol, relatamos a presença de ácido dodecanóico e uma derivada do estigmasterol como componentes do HFBa. Estes compostos têm sido associados à atividade citotóxica observada para a fração hexana do Crocus sativus . Além disso, alguns autores demonstraram que os derivados de estigmasterol apresentaram significativa atividade citotóxica nas linhas celulares cancerígenas que dependiam da apoptose . Em particular, o espinasterol (stigmasta-7, 22-dien-3beta-ol) demonstrou diminuição da incidência de tumores cutâneos in vivo . De fato, o espinasterol e a derivada relatada neste estudo diferem em duplo enlace na posição 22 no espinasterol e na posição 16 para a derivada do estigmasterol. Talvez o estigmasta-7, 22-dien-3beta-ol possa contribuir para a atividade citotóxica observada neste estudo. Além disso, sabe-se que os lanostanos são um grupo de triterpenóides tetracíclicos derivados do lanosterol, que têm múltiplas atividades contra as células cancerígenas, incluindo a indução da apoptose. Possivelmente, os compostos do tipo lanostano e estigmasterol relatados na fração ativa do hexano têm um grau de atividade citotóxica e um efeito de indução da apoptose. É provável que vários compostos presentes na fração hexana atuem sinergicamente para induzir citotoxicidade e apoptose.
3,5. Análise da atividade das caspases
Para saber se o mecanismo de ativação da fragmentação de DNA foi induzido pela ativação da apoptose pela via intrínseca ou extrínseca, avaliamos a atividade das caspases que é característica de cada uma. Os períodos de incubação foram de 2, 4, 6 e 12 h para se obter um perfil de ativação. A caspase 8 foi ativada após 6 h de tratamento com 50 μg/mL de HFBa; o aumento foi três vezes maior em relação às células controle sem tratamento (controle negativo) (Figura 3). Nenhum aumento foi observado na ativação da caspase 8 nos períodos de 2, 4 e 12 h de incubação. A caspase 9 não foi ativada em células KB após tratamento com 50 μg/mL de HFBa durante 2-12 h, o que sugere uma falta de ativação da apoptose pela via intrínseca (Figura 4). A atividade da caspase 3 aumentou quatro vezes em relação ao controle em células tratadas com HFBa, o que está de acordo com a ativação da caspase 8 (Figura 5). O aumento da atividade da caspase 8 é típico da ativação da apoptose por via extrínseca, que por sua vez ativa outras procaspases, entre elas a caspase 3, que por sua vez leva à degradação de proteínas nucleares como a laminina A, fodrina, actina e gelsolina. Também leva à liberação do inibidor da proteína DNase ativada pela caspasa (ICAD), convertendo-a na enzima DNase ativada pela caspasa (CAD), cujo objetivo é a degradação do DNA, conforme representado na Figura 2. Como a caspase 9 não foi ativada, concluímos que a B. albiflora induz a apoptose pela via extrínseca. Isto evidencia o grande potencial que esta fração possui como alternativa ou terapia adjunta no tratamento do câncer. Na literatura existem vários estudos de extratos de plantas e seus efeitos na indução da via intrínseca da apoptose. No entanto, poucos estudos mostraram a ativação da via extrínseca da apoptose por extratos de plantas; por exemplo, o extrato metanólico de Paeonia suffruticosa induz apoptose na linha celular do câncer de estômago humano (AG3), e o extrato de raiz de dente-de-leão tem a capacidade de induzir apoptose na linha celular de leucemia mielomonocítica crônica (CMML) e em células de melanoma resistentes a drogas. Não se sabe qual dos compostos presentes na fração ativa da B. albiflora pode causar a ativação da via extrínseca da apoptose. Independentemente disso, há relatos da indução da apoptose pela ativação de sinalização extrínseca mediada por triterpenóides naturais e sintéticos . Adicionalmente, o triterpenóide tipo lanostana, ácido poliporênico C isolado de Poriacocos, induz a apoptose caspase-8 mediada no câncer de pulmão humano . Notadamente, o β-sitosterol (isômero estrutural do estigmasterol) demonstrou induzir a apoptose pela ativação da via extrínseca, ativando a sinalização Fas nas células humanas do câncer de mama . Isto pode sugerir que tanto os componentes triterpeno e esterol do extrato utilizado neste estudo teriam um papel importante na indução da apoptose mediada pela ativação da via extrínseca.
Tratamento durante 12 horas com ativação da fração caspase 3 induzida por Bonellia macrocarpa hexano. Os tratamentos foram os seguintes: DMSO (0,05%), controle (sem tratamento), etoposídeo (50 μg/mL), e HFBa (50 μg/mL). Cada símbolo é a média ± activação relativa da caspase SD de três ensaios, normalizada com o grupo de controlo. ANOVA unidirecional: , ; teste post-hoc de Tukey: versus DMSO e grupo controle; versus DMSO e grupo controle.
Ao nosso conhecimento, esta é a primeira vez que foi demonstrado que o extrato de uma planta empregada na medicina tradicional Maia possui efeito sobre a apoptose. Futuros estudos serão direcionados para padronizar o extrato e avaliar este último com modelos in vivo. Estudos adicionais são necessários para elucidar os compostos responsáveis pela atividade citotóxica observada e seu mecanismo exato de apoptose.
4. Conclusões
A fração hexânica das raízes de B. albiflora exerce efeitos citotóxicos e induz a apoptose pela via extrínseca, o que sugere seu potencial para o tratamento do câncer. Sugerimos o isolamento completo dos componentes presentes na fração hexânica de B. albiflora. albiflora para avaliação no ensaio citotóxico e indução de apoptose, para elucidar quais são os compostos activos, bem como para compreender o mecanismo de acção.
Conflito de interesses
Este trabalho foi apoiado pelo SEP-CONACYTCB-2010-156755. Os autores gostariam de agradecer a L. Torres-Tapia do Departamento de Biotecnologia do Centro de Pesquisa Científica de Yucatan (CICY) pela assistência técnica durante a análise do GC-MS. Os autores agradecem, ainda, ao Dr. Glenn Jackson pela revisão em inglês do artigo.