A interacção dos raios X com os electrões num cristal dá origem a um padrão de difracção, que matematicamente é a transformação de Fourier da distribuição da densidade de electrões. Os detectores utilizados para medir os raios X, no entanto, só podem medir a amplitude dos raios X difratados; os deslocamentos de fase, que são necessários para utilizar a Transformada de Fourier e encontrar a distribuição da densidade de elétrons, não são mensuráveis diretamente utilizando este método. Isto é conhecido na comunidade física como o “Problema de Fase”. Em termos mais simples, as fases não podem ser encontradas a partir das amplitudes medidas dos raios X. Outras extrapolações devem ser feitas e experimentos adicionais devem ser feitos a fim de se obter um mapa de densidade de elétrons. Muitas vezes, os dados existentes sobre as propriedades físicas e químicas do composto podem ajudar a ajudar quando há um mapa de densidade fraca. Outro método conhecido como Síntese de Patterson é muito útil para descobrir uma estimativa inicial das fases e é muito útil para as fases iniciais determinar a estrutura das proteínas quando as fases não são conhecidas. O problema pode ser simplificado ao encontrar um átomo, geralmente um metal pesado, usando a Síntese de Patterson e depois usando a posição desse átomo para estimar as fases iniciais e calcular um mapa inicial de densidade de elétrons que pode ajudar ainda mais na modelagem da posição de outros átomos e melhorar ainda mais a estimativa de fases. Outro método é chamado de Substituição Molecular; ele localiza a localização da estrutura da proteína na célula. Além do método de substituição molecular, o problema de fase também pode ser resolvido pelo método de substituição isomórfica, o método de difração anômala de comprimento de onda múltiplo, o método de difração anômala de comprimento de onda único e métodos diretos.

ReplacementEdit Molecular

Problema de fase pode ser resolvido tendo um modelo atômico que pode computar fases. Um modelo pode ser obtido se a estrutura proteica relacionada for conhecida. Entretanto, para construir este modelo atômico, a orientação e a posição do modelo na nova célula da unidade precisa ser determinada. Isto é quando a técnica, substituição molecular (ou MR) vem em.

Molecular Replacement, também conhecida como MR, é um método para resolver problemas de fase na cristalografia por raios-X. A RM localiza a orientação e posição de uma estrutura proteica com sua célula unitária, cuja estrutura proteica é homóloga à estrutura proteica desconhecida que precisa ser determinada. As fases obtidas podem ajudar a gerar mapas de densidade de elétrons e ajudar a produzir intensidades calculadas da posição do modelo da estrutura protéica para as estruturas observadas a partir do experimento de cristalografia de raios-X.

MR método também é eficaz para resolver estruturas de cristais macromoleculares. Este método requer menos tempo e esforço para a determinação estrutural, uma vez que derivados de átomo pesado e coleta de dados não precisam ser preparados. O método é direto e a construção do modelo é simplificada porque não necessita de rastreamento em cadeia.

Este método consiste em duas etapas:

1. uma busca rotacional para orientar o modelo homólogo na célula unitária ou alvo
2. um alvo translacional onde o novo modelo orientado é posicionado na célula unitária

Patterson-based (Molecular Replacement)Edit

Patterson maps são mapas vetoriais interatômicos que contêm picos para cada átomo relacionado na célula unitária. Se os mapas Patterson foram gerados com base nos dados derivados dos mapas de densidade de elétrons, os dois mapas Patterson só devem estar intimamente relacionados um ao outro se o modelo estiver corretamente orientado e colocado na posição correta. Isto nos permitirá inferir informações sobre a localização da estrutura desconhecida da proteína com sua célula. No entanto, há um problema com a substituição molecular, ela tem seis dimensões, três parâmetros para especificar a orientação e a posição. Com os mapas Patterson, ele pode ser dividido em subconjuntos dos parâmetros para olhar cada parte separadamente.

Função de RotaçãoEditar

Função de Rotação tem vetores intramoleculares que só dependem da orientação da molécula e não da sua posição porque mesmo quando a molécula é traduzida na célula da unidade, todos os átomos são deslocados pela mesma quantidade, mas os vetores entre os átomos são os mesmos. O mapa Patterson para a estrutura desconhecida da proteína é comparado com a estrutura homóloga conhecida da proteína em diferentes orientações

Função Rotação ClássicaEditar

Para encontrar a orientação, determinar o eixo de rotação e o ângulo de rotação sobre esse eixo. Dois parâmetros serão necessários para definir um eixo (um vetor desde o centro da esfera até um ponto na superfície da esfera). O eixo de rotação começa paralelo ao eixo z e é rodado ao redor do eixo y com ângulo ᶱ, depois o objeto gira ao redor do eixo z com ângulo ᶲ, e finalmente gira ao redor do eixo de rotação com ângulo ᵠ. Estes especificam um ponto na superfície de uma esfera unitária.

Função de Rotação RápidaEditar

A função de rotação pode ser calculada comparando dois mapas Patterson ou os picos desses Pattersons. A função de rotação pode ser calculada muito mais rapidamente com Fourier transforma apenas se os Patterson foram expressos em termos de harmónicos esféricos.

Direct Rotation FunctionEdit

Na função de rotação directa, a estrutura da proteína pode ser colocada na célula da estrutura desconhecida e o Patterson para a molécula orientada é comparado com toda a estrutura desconhecida do Patterson.

Função de translaçãoEditar

Após a orientação da estrutura conhecida é conhecida o seu modelo (mapa de densidade de elétrons) pode ser orientado para calcular fatores estruturais onde uma função de correlação é usada para determinar o vetor para traduzir o modelo no topo do homólogo dentro de uma unidade assimétrica.

Com os modelos de fase da estrutura proteica corretamente orientados e traduzidos, é preciso o suficiente para derivar os mapas de densidade de elétrons a partir das fases derivadas. Os mapas de densidade de elétrons podem ser usados para construir e refinar o modelo da estrutura desconhecida.

Multiwavelength Anomalous DiffractionEdit

X-Rays são gerados em grandes máquinas chamadas synchrotrons. Os synchotrons aceleram os elétrons a quase a velocidade da luz e os percorrem através de um grande anel de polígono metálico oco. Em cada canto, ímãs dobram o fluxo de elétrons, causando a emissão de energia sob a forma de radiação eletromagnética. Como os elétrons estão se movendo à velocidade da luz, eles emitem raios X de alta energia.

Os benefícios do uso de sincrotrons é que as pesquisas não têm que crescer múltiplas versões de cada molécula cristalizada, mas em vez disso crescem apenas um tipo de cristal que contém selênio. Eles então têm a capacidade de ajustar o comprimento de onda para corresponder às propriedades químicas do selênio. Esta técnica é conhecida como Multiwavelength Anomalous Diffraction (Difração Anomalosa Multi-comprimento de Onda). Os cristais são então bombardeados várias vezes com comprimentos de onda de diferentes comprimentos, e eventualmente surge um padrão de difração que permite aos pesquisadores determinar a localização dos átomos de selênio. Esta posição pode ser usada como referência, ou marcador para determinar o resto da estrutura. Os benefícios disto permitem aos pesquisadores coletar seus dados muito mais rapidamente.

Método de substituição isomórficaEditar

Este método compara os padrões de difração de raios X entre o cristal de proteína original e o mesmo tipo de cristal com uma adição de pelo menos um átomo com alto número atômico. O método foi usado para determinar a estrutura de pequenas moléculas e eventualmente a da hemoglobina por Max Ferdinand Perutz (1914-2002). Um isomorfismo perfeito é quando o cristal original e seu derivado têm exatamente a mesma conformação de proteína, a posição e orientação ou as moléculas, e os parâmetros da célula unitária. A única diferença que o cristal e sua derivada têm em um isomorfismo perfeito são as diferenças de intensidade devido à adição de átomos pesados sobre a derivada. Essas diferenças podem ser identificadas manualmente ou por um procedimento de busca automática de Patterson, como SIR 2002, SHELXD, nB e ACORN, e tais informações são importantes para determinar os ângulos de fase da proteína. No entanto, o isomorfismo perfeito dificilmente ocorre devido à mudança nas dimensões celulares. Para a proteína com átomo pesado, sua mudança tolerável na dimensão celular é dmin/4, para dmin é o limite de resolução. Outros fatores, como rotação, também contribuem para o não-isomorfismo.

ProceduresEdit

1. Preparar alguns derivados da proteína em estrutura cristalina. Em seguida, medir a dimensão celular para verificar o isomorfismo.
2. Colher dados de intensidade de raios X da proteína original e sua derivada.
3. Aplicar a função Patterson para determinar as coordenadas do átomo pesado.
4. Refinir os parâmetros do átomo pesado e calcular o ângulo de fase da proteína.
5. Calcular a densidade eletrônica da proteína.

As derivadas são feitas através de dois métodos diferentes. O método preferido é mergulhar o cristal de proteína em uma solução que é composta de forma idêntica ao licor-mãe, mas com um ligeiro aumento da concentração de precipitantes. Outro método é a co-cristalização, mas não é comumente usado porque o cristal não vai crescer ou crescer não isomorficamente. O procedimento de imersão depende da largura dos poros dos cristais. Os poros devem ser suficientemente largos para que o reagente se difunda no cristal e atinja os locais reativos na superfície de todas as moléculas proteicas do cristal.

Método de Difração Anomalosa de Comprimento de Onda MúltiploEditar

Difração Anomalosa de Comprimento de Onda Múltiplo (DMA abreviada) é um método utilizado na cristalografia de raios X que nos permite determinar as estruturas das macromoléculas biológicas, tais como proteínas e DNA, a fim de resolver o problema de fase. Os requisitos para a estrutura incluem átomos que causam dispersão significativa dos raios X; notadamente enxofre ou íons metálicos de metaloproteínas. Como o selênio pode substituir o enxofre natural, ele é mais comumente usado. O uso desta técnica facilita muito o uso do método de Substituição Isomórfica Múltipla (MIR) pelo cristalogrador, pois a preparação de compostos pesados é supérflua.

este método é usado para resolver problemas de fase, quando não há dados disponíveis sobre difração dispersa além de amplitudes. Além disso, é utilizado quando um átomo metálico pesado já está ligado dentro da proteína ou quando os cristais de proteína não são isomórficos, o que não é adequado para o método MIR. O método tem sido usado principalmente para a solução de metallo pesado, estas enzimas metallo normalmente vêm da 1ª série de transição e seus vizinhos. é importante ter uma fonte para um poderoso campo magnético para realizar esta experiência, ambiente como o subterrâneo deve ser considerado. Um acelerador de partículas chamado synchrotron também é necessário para o método.

Método de Difração Anômala de Comprimento de Onda ÚnicoEditar

Em comparação com a Difração Anômala de Comprimento de Onda Múltiplo (DMA), a Difração Anômala de Comprimento de Onda Único (DAS) utiliza um único conjunto de dados de um único comprimento de onda. A principal diferença benéfica entre DMA e SAD é que o cristal passa menos tempo no feixe de raios X com SAD, o que reduz os danos potenciais da radiação à molécula. Além disso, como o SAD utiliza apenas um comprimento de onda, é mais eficiente em termos de tempo do que o DMA.

Os mapas de densidade de electrões derivados de dados de difracção anómalos de comprimento de onda único precisam de sofrer modificações para resolver as ambiguidades de fase. Uma técnica de modificação comum é o achatamento com solvente, e quando o SAD é combinado com o achatamento com solvente, os mapas de densidade de elétrons que resultam são de qualidade comparável aos que são derivados do faseamento completo do DMA. O achatamento com solvente envolve o ajuste da densidade de elétrons das regiões intersticiais entre as moléculas protéicas ocupadas pelo solvente. A região do solvente é assumida como relativamente desordenada e sem características em comparação com a proteína. O alisamento da densidade de elétrons nas regiões do solvente irá aumentar a densidade de elétrons da proteína a um grau interpretável. Este método é chamado ISAS, iterativo de dispersão anômala de comprimento de onda único.

Métodos DiretosEditar

O método direto pode ajudar a recuperar as fases usando os dados obtidos. O método directo estima as fases iniciais e em expansão usando uma relação tripla. A relação tripla (trio) é a relação da intensidade e fase de uma reflexão com duas outras intensidades e fases. Quando se utiliza este método, o tamanho da estrutura proteica é importante já que a distribuição da probabilidade de fase é inversamente proporcional à raiz quadrada do número de átomos. O método direto é a técnica mais útil para resolver problemas de fase.