Materiais e métodos

Recolha de amostras

Participantes com 18 anos ou mais foram convidados a participar do estudo através de notificações por e-mail e anúncios colocados em quadros de avisos na Universidade de British Columbia, Vancouver BC. Os participantes foram convidados a fornecer amostras usando esfregaços bucais com flocos secos (Puritan PurFlock, Fisher Scientific, Waltham MA) e esfregaços bucais com ponta de esponja (Oragene ORAcollect, DNA Genotek, Ottawa, ON) usando instruções auto-guiadas; a ordem em que essas amostras foram dadas foi aleatória por computador. Um assistente de pesquisa esteve presente durante a coleta de amostras para responder às perguntas dos participantes sobre as instruções para a coleta de amostras. Todas as amostras foram armazenadas à temperatura ambiente. Relatórios farmacogenéticos não foram entregues aos participantes, pois isso não estava dentro do escopo deste estudo.

Exploração de DNA

DNA foi extraído usando o kit de extração de DNA baseado em esferas MagMAX Ambion (Applied Biosystems, Foster City, CA) de acordo com as instruções do fabricante. O ADN foi extraído 3 dias após a colheita da amostra e eluído em 60 µl. A quantidade e qualidade do ADN foram avaliadas utilizando o ensaio de fluorescência Qubit 2.0 (ThermoFisher Scientific, Waltham MA). A pureza das amostras foi determinada pelos valores da densidade óptica A260/280 (ODA260/280) usando o espectrofotômetro NanoVue.

Genótipo

Genótipo foi realizado no instrumento QuantStudio 12K Flex de reação quantitativa em cadeia da polimerase (qPCR) (LifeTechnologies, Carlsbad, CA) em ensaios validados pelo fabricante (ThermoFisher Scientific, Waltham MA). O conteúdo dos ensaios incluiu 28 SNPs que influenciam a resposta a medicamentos na plataforma OpenArray (ver Ficheiro adicional 2) e um ensaio CYP2D6 CNV TaqMan (ID do ensaio: Hs_00010001_cn). Para validar ensaios, 44 controles de DNA do Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais (NIGMS), Repositório de Células Genéticas Humanas do Instituto Coriell de Pesquisa Médica foram genotipados. A concordância de chamadas foi confirmada com o genótipo esperado. Além disso, foi confirmado o sequenciamento Sanger dos resultados do DNA de controle. Para cada teste, as amostras dos participantes foram executadas em duplicatas no OpenArray e quadruplicatas no ensaio CNV juntamente com amostras de DNA Corriell usadas como controles positivos e sem controles de modelo (NTCs).

Análise estatística

O software TaqMan Genotyper v1.3.1 (Applied Biosystems) foi usado para determinar as taxas de chamadas de genotipagem do SNP no OpenArray. A taxa de chamadas de genótipos foi calculada para cada ensaio OpenArray, dividindo o número total de genótipos atribuídos com sucesso pelo número total de tentativas de atribuição de genótipos.

Para o ensaio CNV TaqMan o software CopyCaller v2.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) foi usado para atribuir chamadas de números de cópias CYP2D6 e partituras de confiança CNV. Amostras de DNA foram atribuídas a um número de cópia de tipo selvagem e variação do número de cópia (eventos de exclusão ou duplicação) foram agrupadas nos grupos 2N e CNV, respectivamente. Uma taxa de chamadas de genotipagem de 95% e uma pontuação de confiança de 95% foi definida para os resultados de genotipagem SNP e CNV, respectivamente. Um teste t de Student de duas amostras assumindo variações desiguais foi calculado para determinar a diferença significativa entre a produção de DNA, pureza e taxas de chamadas dos diferentes tipos de DNA em pares. As tarefas de genotipagem geradas a partir do tipo de amostra de ADN (com ponta de esponja versus com flocos secos) do mesmo participante foram comparadas para calcular a concordância.

Resultados

Trinta e um participantes foram recrutados e colhidos esfregaços com ponta de esponja e esfregaços com flocos secos. Os participantes encontraram instruções auto-guiadas para a recolha simples e fácil de seguir para ambos os tipos de zaragatoas. Os participantes levantaram questões sobre a pressão necessária para esfregar os esfregaços e a colocação correcta dos esfregaços na boca. Os comentários dos participantes sobre as duas zaragatoas foram semelhantes, com alguns a preferir as zaragatoas com ponta de esponja e outros a preferir as zaragatoas com ponta de esponja; não houve consenso de opinião.

Existiu uma diferença significativa na produção média de ADN entre o ADN colhido com zaragatoas com ponta de esponja e o colhido com ponta de esponja (0,26 ± 0,34 µg vs. 1,91 ± 1,44 µg p = 4,4 × 10-7; Tabela 1). A média de pureza de ADN em todos os tipos de colheita estava na faixa aceita para ADN puro (média (DP)) 1,72(0,78) e 1,85(0,39) para zaragatoas secas e esfregaços com ponta de esponja, respectivamente.

Existiram três amostras colhidas de esfregaços com pontas de esponja com baixas concentrações de ADN (< 5 ng/µl). Estas três amostras tinham taxas de chamada de genotipagem de 100% no OpenArray e 100% de confiança CNV (Fig. 1). Inversamente, uma das amostras que tinha concentração de DNA de 79 ng/µl tinha a menor taxa de chamadas de OpenArray (18%). As maiores taxas de chamada no OpenArray (> 95%) para zaragatoas com fluxo seco foram observadas para sete amostras com concentração variando entre 1,2 e 8,9 ng/µl (Fig. 1a). As maiores chamadas de confiança do VCN (> 95%) foram observadas para amostras com concentração variando entre 1,0 e 24,4 ng/µl (Fig. 1b).

Para todos os ensaios no OpenArray, Amostras de ADN colhidas em esfregaços com ponta de esponja resultaram em taxas de chamada de genotipagem globalmente mais elevadas (97%) em comparação com os esfregaços com flocos secos (54%) (Fig. 2). Com uma etapa adicional de 0,5 × diluição do ADN extraído, as zaragatoas com ponta de esponja tiveram uma taxa consistente de chamadas de genotipagem > 95%. A taxa de chamadas de amostras no OpenArray variou por indivíduo com 29(93,5%) participantes com taxas de chamadas de amostras > 95% de ADN de zaragatoa com ponta de esponja e 4(12,9%) com taxas de chamadas de amostras > 95% de ADN de zaragatoa com ponta de esponja. Foi observada uma concordância de 94% de testes genotipados com sucesso entre esfregaços com ponta de esponja e esfregaços com flocos secos colhidos do mesmo indivíduo.

Chamada de número de cópias para CYP2D6 foram atribuídas a 2(6,5%) das amostras de zaragatoas com ponta de esponja com uma pontuação de confiança global de 0,99. Em comparação, 8(25,8%) das amostras de zaragatoas secas foram atribuídas a chamadas de número de cópias com uma pontuação de confiança global de 0,91 (ver Ficheiro adicional 3).

Discussão

O objectivo desta investigação é ajudar os investigadores, e as empresas, a identificar um método de colheita óptimo que produza ADN de alta qualidade para genotipagem. Este estudo fornece novas informações sobre a qualidade do DNA para dois tipos de esfregaços, que foi elevada (definida como ODA260/A280 1,8) embora tenha havido uma diferença significativa na produção de DNA (p=0,4-7). Na plataforma OpenArray, as zaragatoas com ponta de esponja tiveram a maior taxa global de chamada de genotipagem (97% vs. 54%) e a maior pontuação de confiança no ensaio CYP2D6 CNV TaqMan (0,99 vs. 0,91). Uma taxa de chamada de genotipagem SNP > 95% é considerada como refletindo dados de qualidade aceitável e o escore de confiança do CNV de 99% é considerado de alta qualidade .

Uma amostra de DNA isolada da zaragatoa com ponta de esponja teve uma taxa de chamada abaixo de 95%. Na prática laboratorial de rotina, as amostras com baixa taxa de chamadas seriam recolhidas de novo devido aos resultados incompletos dos relatórios dos pacientes. Omitir esta amostra aumentou a taxa geral de chamada de genotipagem para 99,5% para as zaragatoas com ponta de esponja.

CYP2D6 Os resultados de CNV mostraram um aumento de atribuições de CNV para o ADN colhido a partir de zaragatoas secas 8(25,8%) em comparação com as zaragatoas com ponta de esponja 2(6,5%). O número mais elevado de distribuições de VCN correlacionou-se com escores de confiança mais baixos. A maioria dos participantes 30(97%) foi capaz de coletar amostras que resultaram em altas taxas de chamadas de genotipagem para o esfregaço com ponta de esponja, enquanto apenas alguns poucos indivíduos 4(13%) foram capazes de coletar amostras com altas taxas de chamadas para ambos os tipos de esfregaço. Em conclusão, as zaragatoas com ponta de esponja foram aceitáveis para os pacientes e forneceram ADN de boa qualidade com rendimento suficiente para testes farmacogenéticos baseados em qPCR.