Abstract

A hiperviscosidade do sémen prejudica a mobilidade espermática e pode levar à infertilidade masculina. Este estudo prospectivo teve como objectivo avaliar a capacidade do DNase exógeno na melhoria da qualidade do esperma, tendo em consideração que o DNase foi encontrado no plasma seminal de várias espécies e que os neutrófilos libertam cromatina com o objectivo de reter bactérias. Um total de setenta e sete amostras de sémen com elevada viscosidade seminal (HSV) como grupo de estudo e sessenta e duas amostras de sémen com viscosidade seminal normal (NSV) como grupo de controlo foram comparadas nesta análise. Essas amostras de sêmen foram divididas em três grupos de tratamento (a) com DNase I a 37°C durante 15 min, (b) por centrifugação por gradiente de densidade, e (c) com uma combinação dos dois métodos acima. Após um tratamento de quinze minutos do sémen hiperviscose, a motilidade dos espermatozóides em 83% das amostras de sémen aumentou a um grau estatisticamente significativo. Pelo contrário, o tratamento DNase do sémen com viscosidade normal não teve tais efeitos. O tratamento acima foi também acompanhado por um aumento significativo da percentagem de espermatozóides normais, resultando numa grande diminuição do índice de teratozoospermia. A comparação entre amostras de sémen submetidas a centrifugação com gradiente de densidade após o tratamento DNase I, com as amostras colhidas apenas após o tratamento com gradiente de densidade, mostrou que no primeiro caso os resultados foram mais espectaculares. A avaliação de cada preparação em termos de rendimento (% total de espermatozóides progressivamente móveis após o tratamento em relação ao total inicial de espermatozóides) revelou que a abordagem combinada resultou em 29,8% vs. 18,5% apenas com o tratamento de densidade (p=0,0121). O tratamento DNase I resulta numa melhoria da motilidade e morfologia do esperma e pode ser benéfico para homens com sémen hiperviscose em protocolos de reprodução assistida.

1. Introdução

Estudos documentaram que a hiperviscosidade do sémen (SHV) ocorre em 12-29% dos ejaculados . A SHV é uma condição que pode resultar em infertilidade masculina , pois pode prejudicar seriamente as características físicas e químicas do líquido seminal . Tem sido associada à redução da motilidade espermática, bem como a um mau resultado com fertilização in vitro e aumento da produção de Espécies Reativas de Oxigênio (ROS). Além disso, os níveis de produtos oxidantes seminais têm sido significativamente correlacionados com a viscosidade do fluido seminal em machos inférteis .

Existem fortes indicações da existência de vias inibitórias que prejudicam a qualidade do esperma através da produção de ROS durante o transporte do esperma através do tracto genital masculino , indicações de danos no esperma durante o manuseamento e armazenamento em laboratório , mas também indicações de produção adicional de ROS “automaticamente” após a ejaculação, pelo menos em alguns casos de hiperviscosidade seminal . Esta condição está principalmente associada à infecção da glândula sexual acessória masculina e varicocele , embora a fisiopatologia ainda não seja completamente compreendida. Além disso, a capacidade antioxidante reduzida do líquido seminal foi detectada em amostras de oligoasthenozoospermic em casos de hiperviscosidade seminal . Além disso, os níveis excessivamente gerados de ROS geram peroxidação lipídica perturbando a morfologia da membrana. A presença de níveis aumentados de leucócitos no sémen está associada à SHV . Além disso, os leucócitos são uma fonte importante de ROS e os vetores de retrovírus no sêmen , enquanto sua presença tem sido associada a uma menor probabilidade de concepção, bem como uma menor taxa de sucesso de inseminação intra-uterina (IUI) e de FIV convencional . Além disso, a SHV está correlacionada com a composição da microbiota seminal e com a maior prevalência de bactérias patogênicas .

As abordagens terapêuticas transversais têm sido propostas nos cenários de redução da viscosidade do sêmen de SHV. O excesso de hidratação e a massagem da próstata não foram eficazes. A aspiração e expulsão suave do sémen, através de uma seringa de 5 ml, são quase ineficazes, uma vez que a SHV não é um fenómeno mecânico. A proteólise através do uso de quimotripsina melhora o manuseio do sêmen hiperviscose, embora algumas alterações ocorram nas proteínas espermáticas . Levando em consideração que tal procedimento pode danificar a estrutura do esperma e que na maioria dos casos SHV está correlacionado com a leucocitospermia , nós colocamos a hipótese de que SHV é causado por armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) e que elas são sensíveis à degradação do DNA via DNase I. Até onde sabemos, este é o primeiro relatório de DNase I usado, para tratar SHV.

2. Materiais e Métodos

2.1. Participantes

Um estudo prospectivo foi realizado há mais de 3 anos em pacientes com história de infertilidade na Clínica Médica de Atenas, Locus Medicus, com os seguintes critérios de exclusão: hipogonadismo varicocele, criptorquidismo e obstrução congênita dos ductos seminais. Setenta e sete amostras de sémen com HSV foram obtidas como grupo de estudo e sessenta e duas amostras de sémen normal com NSV foram obtidas como grupo controle, estratificadas da seguinte forma. Inicialmente, um conjunto de trinta e duas amostras de sêmen de HSV e dez amostras de sêmen de NSV foram tratadas com DNase I. Além disso, outro conjunto de vinte e seis amostras de sêmen HSV e cinqüenta e duas de NSV foram processadas pelo método de centrifugação por gradiente de densidade (DGC). Finalmente, dezenove amostras de HSV foram processadas por uma combinação dos métodos, ou seja, o tratamento inicial com DNase I, seguido pelo DGC. Todos os participantes assinaram um termo de consentimento livre e esclarecido antes de qualquer envolvimento.

2.2. Análise do sêmen

Amostras de sêmen, obtidas por masturbação após abstinência sexual por 3-5 dias, foram colocadas em recipientes esterilizados. Após a colheita, as amostras de sémen foram permitidas a liquefazer a 37°C e depois submetidas aos limites de referência da análise convencional de sémen, antes e depois do processo combinado descrito acima]. A motilidade foi avaliada pelo mesmo biólogo oficialmente treinado (ESHRE), que não está envolvido no estudo. A presença de glóbulos brancos (leucócitos) foi avaliada pelo teste de peroxidase (Leukoscreen FertiPro; Bélgica) de acordo com as diretrizes da OMS 2010. Embora a viscosidade pudesse ser avaliada por viscosímetro quantitativo , a viscoelasticidade do sêmen foi estimada usando pipetas plásticas descartáveis que permitiam a queda do sêmen por gravidade e observando o comprimento de qualquer rosca . Homens cujo sêmen tem um comprimento de fio entre 2cm e 4cm são classificados com SHV suave (53,12%); um comprimento de fio entre 4cm e 6cm (40,62%) é classificado como SHV moderado; e um comprimento de fio maior que 6cm é diagnosticado como SHV grave (6,25%) foram incluídos no grupo de alta viscosidade (HV), enquanto a viscoelasticidade foi considerada normal quando o comprimento do fio era de 2 cm ou menos .

2,3. Tratamento com Enzyme

O efeito do DNase I foi avaliado em amostras de sêmen normal e de alta viscosidade. Após a liquefacção, o DNase I foi suavemente aspirado para o recipiente esterilizado com a amostra de sémen até uma concentração final de 20 U/ml e misturado constantemente, seguido de incubação a 37ºC durante 15 a 60 minutos. A motilidade e morfologia das amostras de sémen acima foram analisadas antes e depois da digestão enzimática e a % de PR (motilidade de (a+b) % da contagem total de espermatozóides) espermatozóides antes de qualquer tratamento ser avaliado (ou seja, % inicial de PR).

2,4. Preparação do sêmen

O método de centrifugação por gradiente de densidade (DGC) foi feito de acordo com as recomendações do fabricante. O gradiente de densidade é preparado por camadas de 1 ml de meio 40% sobre o meio PureSperm® (Nidacon International, Gothenburg, Suécia) em um tubo de centrifugação cônico de 15 ml. O sémen foi estratificado no topo do gradiente e centrifugado a 300g durante 20 minutos. A extensão e a força da centrifugação podem variar dependendo da qualidade da amostra: por exemplo, o tempo de centrifugação pode ser aumentado para amostras com alta viscosidade. Após a centrifugação, a maior parte do sobrenadante precisa ser removida suavemente e o sedimento colocado em um novo tubo limpo e bem ressuspenso em 5 ml de meio para remover o gradiente de densidade do meio. Em seguida, é rodado a 200g durante 10 minutos, o sobrenadante removido e o sedimento final ressuspenso no meio estéril para tecnologias reprodutivas assistidas (ART). Finalmente, no tratamento combinatório, as amostras com alta viscosidade foram inicialmente tratadas com DNase I e depois preparadas com o método DGC descrito acima. A concentração, motilidade e morfologia antes e depois da preparação foram determinadas.

Tendo em consideração que a contagem de espermatozóides móveis (TPMSC) após a lavagem pode ser útil para prever a eficácia da inseminação intra-uterina, o rendimento de cada método também foi avaliado da seguinte forma: a percentagem de TPMSC após o tratamento com a preparação de DGC ou DNase I ou com o tratamento combinado com DNase I seguido da preparação de DGC foi dividida pelo número de espermatozóides totais antes do tratamento. Além disso, o resultado da produção (ou seja, % de PR final/ total de espermatozóides antes) foi comparado com a % de PR inicial/ total de espermatozóides antes de qualquer tratamento. O rendimento foi avaliado em amostras de sémen com viscosidade elevada ou normal. Embora não haja consenso sobre o número de espermatozóides móveis administrados no ART, é geralmente aceito que a recuperação do número máximo de espermatozóides móveis de cada amostra de sêmen após qualquer tratamento é de grande importância.

2,5. Análise estatística

Os dados foram analisados por ANOVA unidirecional seguida de comparação múltipla pelo teste Kruskal-Wallis usando o Prisma GraphPad 6.0. Um valor de p menor que 0,05 foi considerado estatisticamente significativo.

3. Resultados

A concentração de leucócitos (leucócitos) é mostrada na Figura 1. Há uma diferença estatisticamente significativa entre todos os grupos (p=0,0238 ANOVA unidirecional). Além disso, a diferença estatística dentro do grupo HV é de 0,0018,

O uso de DNase I aumenta a motilidade dos espermatozóides em homens (32 sujeitos) com alta viscosidade. Como mostra a Figura 2(a), a adição de enzima durante quinze minutos (t=15) melhora a percentagem de (a) movimento de 2,875% para 8,094% de espermatozóides imediatamente após a liquefacção (t=0), o que é estatisticamente significativo (p=0,049, teste de comparação múltipla). Além disso, o movimento PR entre os mesmos pontos de tempo subiu de 27,468% para um estatisticamente significativo 46,59% (p<0,0001, teste de comparação múltipla). Ao mesmo tempo, a motilidade da fração (c) diminuiu de 34,687% (t=0) para 21,5% (t=15) (p<0,0001, teste de comparação múltipla) enquanto a motilidade da fração (d) diminuiu de 37,812% (t=0) para 31,968% (t=15) (p=0,45, teste de comparação múltipla). O uso de DNase I em sêmen com viscosidade normal não aumenta a motilidade dos espermatozóides de forma estatisticamente significativa, em qualquer amostra, como ilustrado na Figura 2(b).

Continuação da incubação por mais quinze minutos (em 21 sujeitos de 32) (por um tempo total de trinta minutos, t=30) aumentou a motilidade de uma fração de espermatozóides para 9,524% (t=30) de 1,761% (t=0) (p=0,046, teste de comparação múltipla) como demonstrado na Figura 3. Curiosamente, o movimento PR melhorou drasticamente de 24% (t=0) para 45,047% (t=30) (p<0,0001, teste de comparação múltipla) de espermatozóides. A motilidade da fração (c) e (d) dos espermatozóides diminuiu de forma estatisticamente significativa de 35,714% para 22,08% (p=0,001, teste de comparação múltipla) e de 40,238% para 32,238% (p=0,039, teste de comparação múltipla), respectivamente. A reavaliação da viscosidade do esperma após tratamento com DNase I mostrou que na maioria dos casos a viscosidade foi normalizada ou pelo menos melhorada.

Comparamos então os resultados de espermatozóides que foram submetidos a centrifugação com gradiente de densidade após o tratamento com DNase I, com estes encontrados apenas após o tratamento com gradiente de densidade. Devido aos limites da amostra, os dois procedimentos não foram utilizados em amostras acumuladas dos mesmos sujeitos, mas em amostras de sujeitos diferentes, cuja viscosidade do esperma era alta. O tratamento de centrifugação por gradiente de densidade também foi utilizado para inseminação intra-uterina (IUI). Como ilustrado na Figura 4, a percentagem de (a) movimento após centrifugação com gradiente de densidade após tratamento DNase I aumentou de 3,416% para 35,083% de espermatozóides (uma melhoria de 10,27 vezes) comparado com 6,333% para 26,866% de espermatozóides (uma melhoria de 4,242 vezes) apenas no caso do tratamento com gradiente de densidade (p<0,0001, comparação múltipla teste Kruskal-Wallis). Quanto à (b) movimentação, após a centrifugação do gradiente de densidade após o tratamento DNase I, a melhora também foi estatisticamente significativa (de 28,583% para 40,916% dos espermatozóides (um aumento de 1,43 vezes), p=0,0112). No grupo de tratamento de centrifugação por gradiente de densidade, a respectiva melhora aumentou de 34,533% para 46,466% dos espermatozóides (uma melhora de 1,34 vezes), embora a diferença entre os grupos não tenha sido estatisticamente significativa (ns, comparação múltipla do teste Kruskal-Wallis). Além disso, o movimento de RP no primeiro grupo aumentou de 32% para 76% dos espermatozóides (2,375 vezes) em comparação a uma melhoria de 1,776 vezes no segundo grupo (de 40,866% para 72,666% dos espermatozóides) (não estatisticamente significativo entre os grupos, comparação múltipla do teste Kruskal-Wallis). A motilidade da fração (c) e (d) dos espermatozóides diminuiu de 36,083% para 10,583% e de 31,916% para 13,583%, respectivamente. A respectiva diminuição no grupo de tratamento de centrifugação por gradiente de densidade sozinho foi de 29,40% para 14,80% (não estatisticamente significativo entre os grupos, comparação múltipla teste Kruskal-Wallis).

A TPMSC pós-lavagem em relação ao número inicial (rendimento) de cada preparação foi avaliada (M&M). O rendimento do tratamento com gradiente de densidade no caso de um indivíduo sem viscosidade do sêmen foi de 27,096% (Figura 5, p/o V-d). O rendimento do mesmo preparo no caso de indivíduos com alta viscosidade (Figura 5, HV-d) foi de 18,519%. A mudança nos dois casos em relação ao seu respectivo controle (ou seja, Figura 5, p/o V, HV) foi estatisticamente significativa (p<0,0001 e p=0,0377, respectivamente, teste Kruskal-Wallis de comparação múltipla), o que denotou que muitos espermatozóides de RP foram perdidos após o tratamento com DGC. Quando os espermatozóides de indivíduos com alta viscosidade foram submetidos ao tratamento DNase (Figura 5, HV-DNase), o rendimento correspondente foi de 42,47%, enquanto a comparação entre o tratamento com gradiente de densidade (HV-d) e o tratamento DNase (HV-DNase) resultou em um p<0,0001 em relação ao grupo HV, comparação múltipla teste de Kruskal-Wallis. Apesar da magnitude do resultado acima, a combinação do tratamento DNase que é seguida pelo tratamento de gradiente de densidade (Figura 5, HV-DNase-d) resultou em 29,782% (p=0,0121 em relação ao grupo HV, comparação múltipla do teste Kruskal-Wallis). Além disso, a preparação combinada (HV-DNase-d) foi comparada com a % de espermatozóides de PR em sêmen de alta viscosidade antes de qualquer tratamento (Figura 5, HV), e resultou em p=0,448, o que significou que a maioria dos espermatozóides de PR foram recuperados. Além disso, em comparação com o grupo w/oV-d, não há diferença estatisticamente significativa como p=0,619 comparação múltipla do teste Kruskal-Wallis.

Próximo, a avaliação da morfologia dos espermatozóides após uma incubação de quinze minutos com DNase I resulta em um aumento estatisticamente significativo da porcentagem de espermatozóides normais de 5,468% para 7,25%, p=0,0197, como ilustrado na Figura 6. Ao mesmo tempo, as anomalias da cabeça diminuíram de 81,75% para 74,937% (p=0,0004), enquanto as anomalias do pescoço diminuíram de 22,062% para 19,343% (p=0,0197). As anormalidades da cauda e a gotícula citoplasmática seguem o mesmo padrão. Como resultado destas alterações na morfologia, é razoável observar um grande impacto no índice de teratozoospermia (TZI). Como mostrado na Figura 6, diminuiu de 1.205 para 1.084 (p<0.0001).

4. Discussão

Neste estudo, nós supomos que a hiperviscosidade do sêmen se origina das redes. Os dados apresentados mostram que a digestão do DNA extrudido das redes é viável, levando à melhoria da motilidade dos espermatozóides. A digestão enzimática do DNA plasmático seminal foi examinada com o objetivo de aumentar a motilidade dos espermatozóides, tornando-os assim adequados para uso em ART. O uso da DNase I após a liquefação dos espermatozóides resultou na melhoria da motilidade e morfologia dos espermatozóides. Foram utilizados vários pontos de tempo de incubação a fim de obter os melhores resultados que foram obtidos após 15 minutos de incubação. O objetivo do estudo foi a melhora do rendimento de inseminação intra-uterina, na coorte de homens de subfertilidade cujos espermatozóides são caracterizados por alta viscosidade muito provavelmente devido a impedimento causado pelo DNA extrudado. Além disso, o uso de DNase I melhorou a morfologia anormal que geralmente coexiste com a alta viscosidade. O enriquecimento espermático também foi avaliado de acordo com o número final de espermatozóides isolados, tanto rápidos como lentos progressivos.

A melhoria estatisticamente significativa da morfologia dos espermatozóides após o tratamento com DNase I pode sugerir que essas anormalidades se materializam após a ejaculação e são mantidas devido à alta viscosidade. Considerando que o sêmen hiperviscose tem capacidade antioxidante total reduzida, a presença de espermatozóides neste ambiente pode induzir peroxidação lipídica e danos no DNA e, eventualmente, comprometimento da morfologia. Pelo menos algumas dessas anomalias morfológicas foram comprovadamente reversíveis pelo tratamento com DNase I. Esta melhora sugere uma aplicação ótima do tratamento acima nos casos em que não há uma demanda tão alta para um grande número de espermatozóides diretamente móveis, como no caso da inseminação intra-uterina, mas onde há demanda para a melhor morfologia possível, como é o caso da FIV ou do procedimento ICSI para fertilização .

Nossos resultados revelam que a aplicação do DNase I só é eficaz na presença de hiperviscosidade. Como mostra a Figura 2(b), na ausência de hiperviscosidade, o DNase I não é eficaz. Especificamente, sob viscosidade normal e independentemente da motilidade dos espermatozóides, a digestão enzimática não resultou em nenhuma diferença estatisticamente significativa em nenhum dos parâmetros examinados. Pelo contrário, na coorte de sêmen hiperviscose, o uso da enzima resultou em melhoria da motilidade de RP de forma estatisticamente significativa, como mostrado na Figura 2(a). Além disso, não houve diferenças na motilidade e na recuperação morfológica dos espermatozóides no grupo HV de acordo com a viscosidade severa ou moderada, embora o número de amostras de sêmen com viscosidade severa tenha sido baixo. Além disso, como mostrado na Figura 5, a diferença estatisticamente significativa após a preparação do DGC entre o grupo de alta viscosidade (HV-d) e o grupo de viscosidade normal (w/oV-d) é de 0,0179, o que sugere que a melhoria é alcançável. Além disso, na mesma figura, o rendimento do tratamento combinado (HV-DNase-d) resultou na recuperação de um percentual de espermatozóides de PR, que atingiu o nível de espermatozóides correspondentes em homens com alta viscosidade (HV) antes do tratamento, já que o percentual final de PR (29,782%, HV-DNase-d) no primeiro caso não tem diferença estatística em relação ao PR inicial (26.478%, HV antes do tratamento), p=0,4480. O significado dessa abordagem combinada, embora diminua o rendimento em comparação ao tratamento DNase isoladamente (p<0001 entre HV-d e HV-DNase), foi substanciado pelo fato de que o tratamento de gradiente de densidade subtraído dos espermatozóides recuperados, (c) e (d) classe espermatozóides equivalentes, purificando-os assim. Em contraste, a diferença estatística correspondente entre o rendimento da preparação de DGC (HV-d, 18,519%) e “HV antes do tratamento” (26,478%) foi significativa (ou seja, p=0,0322).

Além disso, poderia substituir o tratamento mecânico do sêmen hiperviscópico; assim, é comumente diluído ou atraído para uma agulha hipodérmica e forçado a passar para superar a viscosidade elevada. Embora estes métodos não sejam eficazes, pois este tipo de tratamento aumenta a produção de ROS. Além disso, a hiperviscosidade está negativamente correlacionada com a integridade da cromatina como descondensação defeituosa, o que já foi observado .

Em geral, a aplicação de DNase I no trato respiratório já foi medicamente aprovada pelo FDA no caso de fibrose cística . Além disso, o DNase é um componente natural do plasma seminal cujo papel é provavelmente a diluição das redes formadas na via reprodutiva feminina após o recrutamento de neutrófilos em resposta à inflamação, e o procedimento proposto é potencialmente aplicável medicamente no ART. Seu papel também é reforçado pelo fato de sua ausência ter efeitos adversos sobre a inseminação de primatas .

Hiperviscosidade é provavelmente causada por inflamação ou por qualquer disfunção das glândulas seminais, embora o mecanismo exato não seja claro. Pode estar associado a infecções virais do tracto genital, como previamente demonstrado pelo nosso laboratório. Vários protocolos terapêuticos têm sido aplicados com o objetivo de reduzir a viscosidade do sêmen, mas raramente os resultados foram encorajadores. Métodos como a hidratação excessiva e a massagem da próstata não têm dado os resultados esperados. O uso de enzimas proteolíticas como a alfa-cimotripsina deu resultados esperançosos, mas seu uso não foi adotado .

Em outro estudo, DNase I foi usado para diminuir a viscosidade, mas os resultados finais não foram bem sucedidos neste aspecto. Os autores não estudaram parâmetros qualitativos de espermatozóides, ou seja, a motilidade. Além disso, o tempo de incubação foi muito maior (uma hora) do que o proposto (quinze minutos), portanto, o impacto neutro sobre a viscosidade poderia ser atribuído à incubação prolongada da enzima com o plasma sêmen.

Finalmente, apesar dos dados de que a hiperviscosidade do sêmen tem sido correlacionada com a inflamação do trato genital masculino, ou seja vesículas seminais, o que levou ao uso de antibióticos e antioxidantes, estas formas de terapia só podiam tratar esta condição nos casos em que o principal factor era a inflamação. Normalmente, é causada por diferentes fatores que atuam sinergicamente e, portanto, não há terapia causal direta para a hiperviscosidade .

Exposição espontânea a estímulos inflamatórios, neutrófilos, a principal população de leucócitos no sêmen, exercem seu papel protetor através da inativação de bactérias por fagocitose e posterior matança através da exposição a enzimas proteolíticas e ROS. Um segundo modo de ação através do qual os neutrófilos podem neutralizar patógenos é através da produção de armadilhas extracelulares de neutrófilos (NETs) . NETs são redes fibrosas tridimensionais, compostas principalmente de cromatina, que podem aprisionar e imobilizar microorganismos. As redes têm demonstrado ser sensíveis ao DNase, mas não à degradação da protease . Como a formação das redes é baseada no DNA e a DNase seminal demonstrou digerir o DNA extrudido e liberta espermatozóides enredados, nós colocamos a hipótese de que o uso de DNase exógena poderia ser um tratamento valioso em casos de hiperviscosidade seminal causada principalmente pela presença de DNA neutrofílico extracelular exposto.

Do ponto de vista fisiopatológico, o conceito que atribui hiperviscosidade à inflamação quase foi estabelecido. As reações inflamatórias abrangem a formação de redes a partir de neutrófilos para o aprisionamento de microorganismos. É muito provável que os espermatozóides consumam muita energia tentando libertar-se das redes e, consequentemente, o estudo da sua oxidação e estado apoptótico é de grande importância. Além disso, o “efeito de aprisionamento” já descrito é uma consequência da prevenção do movimento dos espermatozóides devido ao seu enredamento nas redes.

Neste estudo, tentamos linchar o DNA extracelular do plasma seminal, que é o componente principal das redes, com DNase I, com vista a libertá-los das redes e recuperar os parâmetros de qualidade dos espermatozóides, ou seja, a motilidade e morfologia. Além disso, como mostra a Figura 1, há uma diferença estatisticamente significativa entre a concentração de leucócitos e o grau de viscosidade. O tratamento proposto é limitado à fase pós-jaculação e não à clínica. Além disso, foi verificada a hipótese inicial de que o aumento da viscosidade dos espermatozóides era resultado da presença de DNA no sêmen, embora sejam necessários mais estudos para confirmar essa hipótese. Levando em consideração que os neutrófilos recrutados formam redes para locais inflamados, levantamos a hipótese de que o DNA no sêmen provém dos neutrófilos. Embora não tenhamos apresentado uma prova direta que sustente esta hipótese, consideramos que, de acordo com nosso conhecimento, a principal fonte possível de DNA é a cromatina dos neutrófilos que é extrudida sob inflamação.

5. Conclusões

Os resultados do nosso estudo apoiam a conclusão de que o tratamento com DNase I proporciona uma melhoria estatisticamente significativa na motilidade e morfologia dos espermatozóides. Ele menciona parâmetros básicos de espermatozóides para o ART, ou seja, motilidade e morfologia, apenas no caso do sêmen hiperviscose. Além disso, nossos achados sugerem que uma das principais causas de SHV é a formação de redes e, portanto, propomos o potencial terapêutico e a utilidade dessa abordagem.

Dados Disponibilidade

Os dados utilizados para apoiar os achados deste estudo estão disponíveis no autor correspondente, mediante solicitação.

Aprovação Ética

Todos os procedimentos realizados neste estudo e envolvendo participantes humanos estavam de acordo com os padrões éticos da Comissão de Bioética e Deontologia da Universidade Nacional Kapodistriana de Atenas, Faculdade de Medicina, aprovada em janeiro de 2014 (Número de referência: 1130).

Consentimento

Todos os pacientes deram seu consentimento livre e esclarecido antes de seu envolvimento no estudo.

Conflitos de interesse

Todos os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Contribuições dos autores

Angelos D. Gritzapis e Vassilis Tsilivakos conceberam o estudo. Effrosyni Nosi, Angelos D. Gritzapis e Vassilis Tsilivakos realizaram a aquisição dos dados, participaram do desenho e redigiram o manuscrito. Effrosyni Nosi realizou os imunoensaios e Angelos D. Gritzapis realizou a análise estatística. Effrosyni Nosi, Angelos D. Gritzapis, Konstantinos Makarounis, Georgios Georgoulias, Vasilios Kapetanios, Christodoulos Papanikopoulos, Anastasia Konstantinidou, Panagiotis Venieratos, Marighoula Varla-Leftherioti, e Vassilis Tsilivakos participaram da análise e interpretação dos dados. Todos os autores leram e aprovaram a versão final do manuscrito.

Agradecimentos

Este projeto foi financiado pelo Laboratório de Diagnóstico Clínico, Locus Medicus S.A.