Bases estruturais do MECANISMO DE AÇÃO

O 16S rRNA da Escherichia coli é bem estudado entre as subunidades do rRNA, e em particular, as interações de vários antibióticos aminoglicosídeos com o 16S rRNA e seus efeitos no processo de tradução do mRNA em polipeptídeo foram examinados (35). Estruturas semelhantes de rRNA existem em outros organismos, como levedura e Tetrahymena (33). O tratamento do rRNA com um aminoglicosídeo protege várias bases nucleicas no rRNA da modificação química, implicando que estas moléculas possuem altas afinidades para certos locais no rRNA. Este modo de ligação foi comparado por Noller (35) com o de inibidores enzimáticos, que geralmente se ligam aos sítios ativos das enzimas e interferem com suas atividades. Diferentes classes de antibióticos aminoglicosídeos ligam-se a diferentes sítios no rRNA, dependendo da complementaridade estrutural entre os dois. Por exemplo, acredita-se que a neomicina, paromicina (Fig. 1), gentamicina e canamicina se ligam ao local A no rRNA 16S em E. coli de forma similar e foram mostrados para proteger as bases A1408 e G1494 em experimentos com pegadas químicas (Fig. 2) (33). Quatro bases, A1408, A1492, A1493, e G1494, no rRNA A-site interagem com o tRNA, embora com afinidades diferentes. A ligação dos referidos aminoglicosídeos ao local A na região de descodificação (ou seja, o local de reconhecimento do códão e do anticódão) interfere com o reconhecimento preciso do tRNA cognato pelo rRNA durante a tradução (35). Estas interações também interferem na translocação do tRNA do local A para o local peptidyl-tRNA (P-site).

Puglisi e colegas de trabalho (12-14, 39) recentemente forneceu evidências estruturais sobre o modo de interação da paromicina, um aminoglicosídeo representativo da classe de neomicina, com um modelo de RNA de 27-nucleotídeos que foi projetado para imitar a região do local A do rRNA de 16S em E. coli (Fig.3A). O desenho do modelo de RNA foi baseado no conhecimento prévio de que a paromicina interage com o par de bases C1407 – G1494, A1408, A1493 e U1495 e que estas bases são absolutamente necessárias para a ligação de alta afinidade (39) (mostrado em cinza na Fig. 3A). Características estruturais adicionais, tais como a bolsa criada pela assimetria na região do laço interno devido à presença de A1492 e o par de bases de C1409 – G1491 na região inferior da haste, também são importantes. Estas características estruturais criam colectivamente uma bolsa que é óptima para a ligação da paromicina (ver abaixo).

No modelo de RNA do local A nativo, a haste tem interações de para-base em U1406 – U1495 (não canônico) e C1407 – G1494 (Fig. 3A). Ao ligar a paromicina, a estrutura distinta formada por A1408, A1492 e A1493 é estabilizada (Fig. 2B) e as bases A1408 e A1493 formam um par de bases não-canônicas (12, 39). O nucleotídeo A1492, que não tem nenhuma interação de par de bases, cria uma dobra na estrutura do RNA, e os efeitos combinados do A1492 e do par de bases A1408 – A1493 cria uma protuberância no local A onde a paromicina liga e estende ainda mais o ângulo da dobra (Fig. 2B). Os grupos funcionais da paromomicina, como os grupos hidroxila e amino, participam de interações específicas com a molécula de RNA (veja abaixo).

A bolsa criada por A1492 e o par básico A1408 – A1493 é ocupada pelo anel II da paromomicina, e este anel se empilha acima da base G1491 (mostrado por uma seta amarela na Fig. 2B) (12). O anel I de paromomicina faz contatos específicos com os pares de bases “universalmente” conservados U1406 – U1495 e C1407 – G1494 no rRNA. É de salientar que o anel I é absolutamente necessário para a ligação específica dos antibióticos aminoglicosídeos ao rRNA. Os anéis III e IV de paromomicina estendem estas interações ainda mais para a ranhura principal do rRNA. Os amino e hidroxil moieties contribuem principalmente para as interações inespecíficas da paromomicina com o rRNA; portanto, não são interações dependentes de seqüência. Outro ponto importante é que o par base C1409 – G1491 fornece o assento para a ligação do aminoglicosídeo no bolso, e um par base não compatível nesta posição resulta na perda da ligação (12). Em geral, os aminoglicosídeos que partilham características estruturais com a ligação da paromomicina ao rRNA de forma semelhante (13). Entretanto, antibióticos aminoglicosídeos diferentes parecem ligar-se ao mesmo local de ligação em mais de uma conformação (28). Em essência, a conformação do aminoglicosídeo que se liga ao RNA deve satisfazer as restrições eletrônicas e estéreis do local de ligação. Em um estudo diferente sobre o complexo de gentamicina Cla e o modelo de RNA do local A, os anéis I e II de gentamicina Cla (que são similares aos da paromicina) exibiram interações de ligação similares às do complexo de paromicina e do modelo de RNA do local A (57). No entanto, o anel III da gentamicina Cla interage com os pares de bases U1406 – U1495 e G1405 – C1496 na região superior do tronco (Fig. 3A). A partir destas observações, Puglisi e colegas de trabalho (57) propuseram que todos os aminoglicosídeos que visam o local A do rRNA 16S se liguem de forma comum, semelhante aos anéis I e II em paromomicina e gentamicina.

Embora a estrutura geral do rRNA seja conservada entre todas as espécies num sentido evolutivo, existem diferenças que tornam a ligação dos aminoglicosídeos mais específica – pelo menos 10 vezes maior – ao rRNA dos procariotas do que à dos eucariotas (19, 35, 38). Isto não é uma grande diferença na afinidade de ligação e pode explicar em parte os efeitos tóxicos destes antibióticos nos sistemas de mamíferos. O rRNA eucariótico contém uma guanina no lugar de A1408, resultando num par de base G1408 – A1493. Além disso, o par de base combinado em C1409 – G1491 não existe em eucariotas. Essas diferenças resultam coletivamente em menores afinidades de aminoglicosídeos para o rRNA eucariótico (12, 19, 35, 38). Tendo delineado estas diferenças, a ligação de aminoglicosídeos ao local A do rRNA em procariotas altera a conformação do local A e afecta as interacções específicas do mRNA e tRNA neste local, resultando em interacções erráticas do códon-anticódon. Existe uma escassez de informação estrutural sobre as especificidades destas interacções a nível ribossómico até à data (ver abaixo), mas a consequência clara e última é a perturbação do processo de tradução.

Foi realizado um outro estudo estrutural sobre a ligação da tobramicina (Fig.1) a um aptamer de RNA (23). O aptamer de RNA utilizado neste estudo foi um RNA com 26-nucleotídeos (Fig. 3B). Neste aptamer de RNA há quatro pares de desalinhamentos, U7 – G20, G8 – U19, G9 – A18, e U11 – U16, que fazem parte do laço do grampo de cabelo com zíper. A tobramicina se liga neste sulco parcialmente encapsulado pela superfície do sulco profundo e a base guanina do resíduo G15 (Fig. 4). Neste complexo, o anel I de tobramicina senta-se no chão da ranhura profunda. Um dos aminogrupos do anel II de tobramicina interage com a espinha dorsal de fosfato no sulco profundo, e o outro aminogrupo é exposto ao solvente. O anel III é posicionado no centro da ranhura profunda, com grupos hidroxil dirigidos para o piso da ranhura. A conformação do aptamer de RNA descrita acima foi sugerida para ser semelhante às das alças dos grampos capilares em tRNA e rRNA (23).

A estrutura de raios X de 7,5-Å-resolução do complexo funcional doT. thermophilus 70S rRNA contendo tRNA e mRNA é útil para colocar a discussão acima em perspectiva (5). A partir desta estrutura, pode-se visualizar como o modelo estudado com modelos menores de RNA, como o aptamer de tobramicina-RNA e o RNA do local A com paromomicina (ver acima) se encaixaria na estrutura completa do rRNA. O A-site na subunidade 16S rRNA do rRNA 70S é visto perto da interface do tRNA e da subunidade 50S rRNA, na proximidade do par códon-anticodon (Fig. 2A). Ao comparar a estrutura de solução do modelo de RNA do local A com o local A na estrutura de raios X do rRNA 70S, a estrutura de raios X parecia estar intimamente relacionada com o modelo de RNA ligado à paromicina, mas não com a estrutura de solução nativa do modelo de RNA do local A (5). Isto é intrigante e sugere que talvez na forma funcional a protuberância ou dobra perto das bases A1492 e A1493 sempre existe no rRNA 70S. Se isto fosse verdade, implica que a bolsa de ligação para paromomicina já existe quando o rRNA 70S se torna funcional; portanto, está predisposto para inibição pela paromomicina. Isto contradiz a afirmação de que a ligação da paromomicina aumenta o ângulo de dobra no local de ligação. Evidências em apoio a esta idéia vêm de um estudo recente que sugeriu que as afinidades dos diferentes aminoglicosídeos para o modelo de RNA do local A são diferentes, e a capacidade destes antibióticos de inibir a síntese protéica in vitro também varia (15). A gentamicina e vários outros antibióticos relacionados interagem com o RNA do local A com constantes de dissociação (Kd) na faixa micromolar, mas inibiram um processo de translação in vitro, com concentrações inibitórias de 50% na faixa nanomolar (15). Este último achado foi inferido como resultado da ligação do aminoglicosídeo ao rRNA intacto na região de descodificação (A-site), e a diferença na ligação ao rRNA intacto em relação ao RNA modelo A-site pode ser devida às diferenças nas conformações destes dois RNAs, como discutido acima.

O A-site faz contatos fracos com o mRNA e o tRNA, implicando que esta região tem um papel no reconhecimento do tRNA apropriado através de mudanças sutis na energia livre (5). A ligação do aminoglicosídeo perto deste sítio pode afectar o delicado processo de interacção entre o códão e o anticódão. Também foi proposto que a presença de um aminoglicosídeo estabiliza o complexo de mRNA e tRNA no local A, o que por sua vez afeta o processo de tradução (5). É difícil supor todos os efeitos dos aminoglicosídeos sobre a estrutura do rRNA, e outros estudos estruturais com os aminoglicosídeos ligados aos complexos, como o rRNA 70S, serão úteis para elucidar e compreender as mudanças sutis que levam às ações antibióticas dos aminoglicosídeos.

Um número de investigações tem usado sondas sintéticas para compreender as interações entre os modelos de RNA e os aminoglicosídeos. Tem sido sugerido que os aminoglicosídeos se ligam a mais de um local alvo na ribozima (6, 30). Recentemente, vários antibióticos aminoglicosídeos como neomicina B, tobramicina e canamicina A foram dimerizados simétrica ou assimetricamente usando uma “corda”, e suas afinidades de ligação foram comparadas com as dos aminoglicosídeos monoméricos de origem (30). Foi sugerido que se houvesse múltiplos locais de ligação no RNA, os aminoglicosídeos dimerizados deveriam se ligar com uma afinidade maior do que o antibiótico pai, desde que múltiplos locais de ligação estivessem acessíveis. Foi realmente observado que os aminoglicosídeos dimerizados se ligam à ribozima Tetrahymena 20 a 1.200 vezes melhor do que os aminoglicosídeos parentais. Uma explicação para a maior afinidade de ligação poderia ser o aumento do número de grupos de amino cargas positivas no aminoglicosídeo dimerizado, mas este efeito parece ser sinérgico com a vantagem entrópica obtida pela dimerização (30). Também indicou a presença de múltiplos locais de ligação de alta afinidade para antibióticos aminoglicosídeos em uma molécula de RNA. Outro estudo tentou explorar as propriedades de ligação do RNA da paromicina e os comportamentos de intercalação de certos compostos como o pireno e o tiazol laranja (48). Esta estratégia vislumbrou os aminoglicosídeos como um meio para a entrega de agentes intercaladores ao RNA. O conjugado da paromicina com o tiazol laranja ou pireno mostrou melhores propriedades de ligação com o modelo de RNA de 27-nucleotídeos A. De fato, a constante de dissociação para o conjugado paromomicina-tiazol laranja foi medida em 46 nM, o que foi relatado como a maior afinidade que o rRNA A-site mostrou para qualquer ligante.

Os requisitos estruturais para a ligação do RNA por aminoglicosídeos indicaram que uma protuberância na seqüência do RNA é necessária para permitir a ligação de aminoglicosídeos (7). Usando uma derivada específica do aptamer de RNA, uma série de estudos de interferência química, modificação química e mutação foi realizada para entender as exigências estruturais para ligação de tobramicina ao aptamer de RNA. Este aminoglicosídeo parecia interagir principalmente com as bases nucleicas do RNA aptamer, mas não com a espinha dorsal de fosfato. A presença de uma protuberância, entretanto, foi proposta para ser importante para a ligação de alta afinidade da tobramicina numa relação estequiométrica, e concluiu-se que uma protuberância cria uma cavidade para interações do aminoglicosídeo e da base nucléica (7). Esta analogia pode ser aplicada a outros locais de RNA, como a região de cabeça de martelo e o local A, onde uma cavidade está presente devido ao emparelhamento não canônico da base ou loops ou bulges que criam um local adequado para os aminoglicosídeos interagirem com os grupos de fosfato aniônico e as bases nucléicas. Nesta linha, Westhoff e colegas (49) apresentaram uma proposta de que a interação dos aminoglicosídeos com o RNA provavelmente terá uma forma específica e não uma seqüência específica.

De acordo com este conceito, os campos eletrostáticos nas pregas de RNA foram considerados como a força guia para a ligação (ver abaixo). Hermann e Westhoff (20) foram capazes de identificar as confirmações de acoplagem de vários antibióticos aminoglicosídeos em vários modelos de RNA, como os aptamers de tobramicina-RNA e a região do local A no RNA 16S, para os quais havia informações estruturais disponíveis. Com base nessas observações, foi previsto o modo de ligação dos aminoglicosídeos à região do elemento de resposta transminoglicósido no HIV (20). Em outro estudo sobre RRE em HIV, a região de ligação da proteína Rev, Cho e Rando (8) investigou o papel de um bulbo de base única e uma cavidade para ligação de aminoglicosídeos. Consistente com hipóteses anteriores, foi deduzido que os sulcos nas regiões não duplex do RNA são importantes para a ligação de alta afinidade dos aminoglicosídeos ao RNA. Neste caso, o sulco de base única não afetou a ligação, mas a cavidade, uma região rica em G constituída por dois pares de bases nãocanônicas e um único U abaulado, tem alta afinidade para aminoglicosídeos. A adulteração da cavidade diminuiu a afinidade do RNA RRE para aminoglicosídeos, indicando assim que os bulges nãocanônicos contendo pares de bases são os locais primários de ligação dos aminoglicosídeos neste modelo de RNA (8).