Proteínas precisam interagir com outras proteínas para formar complexos funcionais. Em muitos casos, a função da proteína dentro das células não pode ser compreendida sem informação sobre a estrutura da proteína e conhecimento de qual complexo a proteína está situada.1, 2 Isto é, por exemplo, de suma importância para as proteínas que modulam a informação epigenética no DNA. Quase todas estas proteínas modificadoras da cromatina requerem interação intensiva com enzimas metabólicas, que fornecem os co-fatores necessários para a acetilação, desacetilação ou metilação e desmetilação históricas.3-5 Isto mostra a necessidade de estudar o ambiente complexo de uma determinada proteína para analisar sua função e estado de atividade. A reticulação proteica, em combinação com a análise por espectrometria de massa (XL-MS), é ideal como método para obter informações sobre a estrutura da proteína e a composição dos complexos proteicos.6-9 Para XL-MS, são necessários reagentes químicos especializados, reticuladores, capazes de conectar covalentemente resíduos proteicos que estão próximos, por exemplo, interagindo em um complexo.10, 11 A caracterização dos peptídeos reticulados por meio da espectrometria de massa, no entanto, representa um desafio formidável por duas razões. Em primeiro lugar, a identificação dos peptídeos reticulados tem de ser obtida através da análise de iões fragmentos não só de um, mas também de dois peptídeos ligados, complicando assim enormemente os espectros de MS2. Em segundo lugar, as espécies de peptídeos reticulados têm apenas uma abundância muito baixa e fazem parte de uma mistura de peptídeos que é esmagadoramente dominada por peptídeos não reticulados. Em muitos casos, isso leva a uma dramática perda de informação que dificulta a identificação precisa dos peptídeos reticulados e, portanto, a análise interativa. Alguns reagentes de reticulação cruzada foram desenvolvidos, os quais introduziram grupos de MS-preparáveis, e a possibilidade do enriquecimento de XL para enfrentar estes problemas.12-18

Herein, relatamos o desenvolvimento de um novo reagente de reticulação cruzada que é enriquecedor e tem propriedades de clivagem que permitem a identificação precisa de reticulação cruzada. O cliXlink projetado (1) está representado na Figura 1. O reagente permeável a células (Figura 1 A e Figura S1 na Informação de Suporte) apresenta duas unidades de éster succinimidil que podem reagir com nucleófilos em proteínas e estão espaçadas aproximadamente 9 Å entre si; permitindo assim a fixação de distâncias curtas para obter informação estrutural sobre as proteínas e capturar proteínas nas proximidades umas das outras. A clevabilidade eficiente da EM é assegurada pelo grupo bem estabelecido de sulfóxido, que pode ser clivado sob condições de dissociação induzida por colisão (CID) de baixa energia, antes da fragmentação do peptídeo. Além disso, uma unidade alquídica permite que uma fracção de enriquecimento, por exemplo, biotina, seja ligada aos locais reticulados com a ajuda da reacção CuAAC.19

Aplicação do reticulador pode seguir o fluxo de trabalho descrito na Figura 1 B. Envolve a adição do reagente 1 a um proteoma complexo, fixando a informação de distância do estado nativo dos peptídeos em proximidade próxima e preservando-os ao longo do fluxo de trabalho adicional para análise da EM. A anexação do grupo de afinidade para enriquecimento é realizada após a ligação cruzada para evitar a interferência de grupos de enriquecimento volumosos. Através da modificação dos peptídeos reticulados ao nível da proteína, o excesso de reagentes de pequenas moléculas pode ser prontamente removido pela precipitação de acetona. Isto é seguido pela digestão enzimática das proteínas. Os peptídeos reticulados são rotulados desta forma, por exemplo, com biotina, o que permite o seu enriquecimento. Posteriormente, são analisados através da espectrometria de massa. Como as massas individuais dos peptídeos em um crosslink não são imediatamente acessíveis, a atribuição de crosslink é difícil, especialmente em amostras complexas. Isto requer o uso de reagentes com EM, que facilitam a identificação de MS2 através da formação de iões fragmentos específicos.20, 21 Na melhor das hipóteses, o reagente deve também permitir experiências com MS3, o que requer que o crosslinker seja clivado antes dos peptídeos. Isto permite que os peptídeos sejam separados para identificação individual baseada em MS3. Nosso reagente 1 contém β- átomos de hidrogênio em ambos os lados do sulfóxido, de modo que a fragmentação ocorre em duas direções, como mostrado na Figura 1 C. Isto leva a uma separação limpa dos peptídeos (α, β) e gera dois fragmentos para cada peptídeo: um alqueno e um fragmento de ácido sulfênico; este último forma um talo após a perda de água. Isto fornece dois pares de massa com uma característica Δm/z≈32. É importante observar que a via de fragmentação a (Figura 1 C) predomina. Portanto, para o α-peptide o fragmento de alqueno, e para o β-peptide o fragmento de thial, são os principais produtos de clivagem. Devido às propriedades assimétricas da clivagem, a maior parte da intensidade do sinal é retida em um fragmento por peptídeo, o que deve proporcionar excelente sensibilidade em experimentos com MS3.

A síntese do reagente 1 é simples (Esquema 1). O ponto de partida é o dímero de dissulfeto oxidado da homocystein 2, que é tratado com ácido 4-pentinoico para dar o dissulfeto 3. A clivagem redutiva do dissulfureto e a alquilação dos tióis gerados com o 3-bromopropionato de metilo gera o composto de sulfureto 4. A saponificação de ambos os ésteres metílicos para 5 e a conversão de 5 em éster bissuccinimidílico 6 activado, seguida da oxidação do tioéter para o sulfóxido, dá ao reagente 1 num rendimento total de 16 %. De particular importância é que o reagente é muito puro e as unidades de ésteres reactivos estão no lugar em ambos os lados. A hidrólise parcial deve ser evitada. Isto foi assegurado por uma purificação de precipitação final. O reagente 1 foi dissolvido numa mistura de acetato de etilo e diclorometano e precipitado após a adição de hexanos.

Em seguida, investigamos as propriedades da EM de 1. Para este fim, adicionamos 1 à proteína modelo comumente usada, albumina de soro bovino (BSA). Seguimos o fluxo de trabalho descrito na Figura 1 B sem realizar a etapa de enriquecimento. Em resumo, após a adição de 1 à solução proteica e a reacção durante 1 h à temperatura ambiente e pH fisiológico, precipitámos a proteína com acetona, ressuspensámo-la em tampão (ver Informação de suporte) e digerimos a proteína subsequentemente com uma mistura de tripsina e Lys-C.

A mistura de peptídeo obtida foi dessalgada com colunas C18 Tip e analisada por meio de HPLC-MS2 (Figura 2). A figura 2 A mostra dois peptídeos BSA reticulados (α+β) como exemplo. Após a determinação da massa exata do crosslink intacto (m/z 677.1; Figura 2 B), realizamos a fragmentação do CID e do HCD no precursor para avaliar as propriedades de fragmentação (Figura 2 C). Uma fragmentação mais seletiva do CID (excitação por ressonância do íon crosslink; Figura 2 C, espectro superior) a uma baixa energia de colisão normalizada de 25% fornece, como esperado, apenas um pequeno conjunto de sinais intensos. Dois pares de sinais proeminentes, com Δm/z de 32 (Δmrep), são obtidos devido à fragmentação do crosslinker, que resulta em um fragmento thial (α-/β-thial) e alkene (α-/β-alkene) para cada peptídeo. Como mencionado anteriormente, a via de fragmentação a (Figura 1 C) é preferível, levando a uma distribuição de intensidade assimétrica. A formação dominante dos peptídeos intactos e separados esperados, consequentemente, torna o reagente passível de ser utilizado em experimentos mais sofisticados de MS3.

Para nosso estudo, utilizamos a fragmentação do HCD. Este método proporciona uma clivagem cruzada simultânea e formação dos fragmentos do peptídeo necessários para a identificação (Figura 2 C, espectro inferior). Para ajudar no reconhecimento de crosslink/peptide, é importante que a fragmentação do HCD ainda forneça o alkene e os fragmentos do peptídeo. Os dados de HCD, portanto, permitem a identificação de peptídeos por MS2.

Utilizando este método, analisamos os dados com o software MeroX livremente disponível, filtrando rigorosamente todas as identificações de crosslink (pontuação >50, taxa de descoberta falsa (FDR) 1 %) e exigindo a presença de pelo menos três em cada quatro íons dos dois pares de massa característica.23, 24 Sem explorar a possibilidade de enriquecimento baseado em CuAAC, fomos capazes de identificar 61 crosslinks BSA únicos em uma única medição (Figura 2 D).25 Este resultado é representativo para medições realizadas com BSA purificado em nosso laboratório. Além disso, descrevemos as ligações cruzadas encontradas na estucagem do cristal de BSA e observamos que a maioria das distâncias medidas eram razoáveis. É importante ressaltar que as ligações cruzadas mostram uma distância média Cα-Cα entre os aminoácidos reticulados de 22,1 Å e uma distribuição de distância que está em perfeita concordância com o que é esperado para as ligações cruzadas com um reagente que espaça os ésteres ativos por cerca de 9 Å (Figuras 2 E e S2)26 e levando em conta o comprimento da cadeia lateral e a dinâmica molecular das proteínas.27 O crosslinking ocorreu principalmente entre dois resíduos de Lys (49 %), mas também detectamos conexões Lys-Thr (30 %), Lys-Ser (13 %) e Lys-Tyr (8 %), de acordo com a reatividade dos ésteres succinimidílicos (Figura 2 F).28

Este sucesso nos permitiu validar o novo crosslinker em um ambiente mais complexo. Queríamos particularmente mostrar o valor adicional da possibilidade de enriquecimento baseado no CuAAC. Para este experimento, nós novamente cruzamos a proteína BSA (10 μg), precipitamos com acetona, redissolvemos a proteína reticulada e posteriormente realizamos a reação de clique (Figura S3 A) adicionando 7 (Figura 3 A) e CuSO4/tris(3-hydroxypropyltriazolylmethyl)amine (THPTA) seguido pela redução do CuII ao CuI após a adição de ascorbato de sódio. Após 1 h à temperatura ambiente, realizamos outra precipitação de acetona para remover o excesso de azida biotina. Em seguida, adicionamos tripsina e Lys-C para digestão.

Estes peptídeos que em seguida combinamos com uma digestão de proteína obtida a partir de um extrato de célula HEK (435 μg de proteína; Figura 3 B). Isto cria um fundo maciço de peptídeos não reticulados. Se analisarmos agora as ligações cruzadas dentro deste grande fundo (Figura 3 C), identificamos apenas um número muito pequeno de ligações cruzadas (CSMs médios=5,0), locais únicos ligados entre si (XLs médios=3,7) assim como ligações monoligadas (média=5,3), nas quais um éster succinimidil hidrolisado antes da reacção com a proteína. No entanto, se realizamos o enriquecimento com contas magnéticas revestidas com estreptavidina, o número de identificações de reticulação melhorou drasticamente. Após a incubação da mistura de peptídeo com as partículas magnéticas; lavagem extensiva (6×) das contas com tampão (ver Informação de suporte) e clivagem suave e redutora do dissulfeto para libertar os crosslinks “capturados” e assim remover a biotina (Figura S3 B), detectamos agora, em média, 95,0 CSMs e 37,0 XLs únicos juntamente com 184,3 monolinks. O número de XLs únicos identificados foi inferior ao do BSA purificado (Figura 2 D), o que poderia ser explicado por ineficiências na reação CuAAC ou interferência do fundo complexo não reticulado. Contudo, este resultado mostra que nosso novo reticulador, 1, é capaz de enriquecer peptídeos reticulados em um vasto excesso de peptídeos não modificados; facilitando assim a análise de amostras complexas com reticuladores de baixa abundância. Originalmente, estávamos cépticos quanto à estrutura assimétrica do 1. Os dados, porém, mostram que, apesar disso, um grande número de crosslinks é identificado.

Em resumo, nosso novo crosslinker 1 combina as seguintes vantagens: em primeiro lugar, o tamanho do reagente é ideal para obter informações valiosas de distância para a proteômica estrutural. Além disso, a molécula é permeável às células e a unidade alquídica não causa grande interferência com a reação de reticulação. Além disso, a fragmentação robusta e eficiente do sulfóxido simplifica a identificação das reticulações. A possibilidade de funcionalidade dos peptídeos reticulados com a química de 1 por clique permite diversas modificações e estratégias de enriquecimento que permitem a análise de reticulados de baixa abundância. Para concluir, o nosso reagente 1 abre agora o caminho para análises complexas interativas, utilizando experiências com MS2 e MS3.

Conflito de interesses

Os autores declaram não haver conflito de interesses.