TESTMETHODEN FÜR PHOTOTOXIZITÄT UND TIERALTERNATIVEN

Es ist wichtig, die Photosicherheit von Chemikalien zu gewährleisten, wenn die Möglichkeit einer Exposition des Menschen besteht, wie dies bei Arzneimitteln (20) oder Kosmetika (21) deutlich zu sehen ist. Um das Phototoxizitätspotenzial einer Chemikalie zu bewerten, wurden verschiedene Testmethoden eingeführt, die von In-silico-(22), In-Chemico-(23), In-vitro- bis hin zu In-vivo-Tests reichen. In chemico-Tests wie die Erzeugung von ROS (24), in vitro-Tests wie der 3T3-NRU-Test und das 3D-Epidermismodell sowie in vivo-Studien mit Meerschweinchen, Mäusen oder pigmentierten Ratten wurden entwickelt und werden routinemäßig angewandt (25).

Lichtquelle für Phototoxizität. Die Lichtquelle für die Phototoxizität ist äußerst wichtig, da die von der Testchemikalie absorbierten Wellenlängen (Absorptionsspektrum) und die Lichtdosis (die in einer angemessenen Expositionszeit erreicht werden kann) ausreichen sollten, um Phototoxizität zu induzieren (26). Sonnensimulatoren, die das natürliche Sonnenlicht simulieren, gelten als ideale künstliche Lichtquelle (Abb. 5).

Die Strahlungsleistungsverteilung des gefilterten Sonnensimulators sollte derjenigen des Tageslichts im Freien nahe kommen. Sonnensimulatoren sind mit Xenonlichtbögen oder (dotierten) Quecksilber-Metallhalogenid-Bögen ausgestattet. Sie sollten auch mit geeigneten Filtern ausgestattet sein, um die stark zytotoxischen UVB-Wellenlängen abzuschwächen. Das unter diesen Filtern erfasste Spektrum sollte nicht vom standardisierten Tageslicht im Freien abweichen (Spezifikation: FDA CFR Part 201.327, ISO 24444:2010(e), CIE-85-1989).

Allerdings können auch andere UVA-Lichtquellen wie UVA-Lampen mit einem geeigneten UV-Dosimeter zur Überprüfung der Intensität und Wellenlänge verwendet werden. Die Lichtintensität (Bestrahlungsstärke) variiert je nach Quelle und sollte regelmäßig vor jedem Phototoxizitätstest mit einem geeigneten Breitband-UV-Meter überprüft werden. Das UV-Messgerät muss vor jeder Messung kalibriert werden. Dementsprechend hängt die Bestrahlungszeit von der Intensität der Lichtquelle ab (z. B. sind bei einer Lichtquelle von 1,7 mW/cm2 50 Minuten Belichtungszeit erforderlich, um 5 J/cm2 zu erreichen). Die Bestrahlungszeit variiert auch in Abhängigkeit von den Prüfmethoden. Eine Dosis von 5 J/cm2 (gemessen im UVA-Bereich) erwies sich als nicht zytotoxisch, war jedoch stark genug, um Chemikalien anzuregen und phototoxische Reaktionen im 3T3 Neutralrot-Aufnahmetest auszulösen.

3T3 Neutralrot-Aufnahme-Assay. Der 3T3-NRU-Assay wurde von der OECD offiziell genehmigt und am 13. April 2004 als OECD TG432 bestätigt (3). Mit diesem Test wird die Photozytotoxizität bewertet, indem die relative Verringerung der Lebensfähigkeit der Zellen nach Exposition gegenüber dem Prüfgegenstand in Anwesenheit bzw. Abwesenheit von UV/VIS-Bestrahlung bestimmt wird. Die Entscheidung, den 3T3-NRU-Phototoxizitätstest durchzuführen, wird für die Chemikalien getroffen, die Absorptionsspektren im UV/VIS-Bereich aufweisen, wenn sie in einem geeigneten Lösungsmittel aufgelöst sind (17). Wenn der molare Extinktions-/Absorptionskoeffizient weniger als 10 l x mol-1 x cm-1 beträgt, ist es unwahrscheinlich, dass die Chemikalie photoreaktiv ist (z. B. muss die OD einer 0,05-M-Lösung in einer UV-Küvette mit 1 cm langem Lichtweg weniger als 0,5 betragen, um als nicht photoreaktiv zu gelten, basierend auf der Gleichung „Absorption = Extinktionskoeffizient x Weglänge x Konzentration“) (26). Der 3T3-NRU-Test weist eine hohe Sensitivität, aber eine geringe spezifische Vorhersagekraft auf (Sensitivität von 93 % und Spezifität von 84 %). Der 3T3-NRU-Test hat viele Einschränkungen. Er kann keine anderen schädlichen Wirkungen als Photo(zyto)toxizität vorhersagen, die durch die kombinierte Wirkung einer Chemikalie und von Licht entstehen können, wie z. B. Photogenotoxizität, Photoallergie (Photosensibilisierung) oder Photokanzerogenität. Der 3T3-NRU-Test wird nur zur Identifizierung von Gefahren eingesetzt, während seine Nützlichkeit für die Bewertung der phototoxischen Potenz nicht gewährleistet ist; insbesondere fehlt diesem Testsystem die metabolische Aktivität, die für die Manifestation systemisch exponierter Chemikalien entscheidend ist. Daher werden für systemisch exponierte Chemikalien, die eine metabolische Aktivierung erfordern, wie Monocrotalin, Riddelliin und Heliotrin (Pyrrolizidinalkaloide) (28), In-vivo-Tierstudien empfohlen (5,29).

Grundlegendes Testprinzip von 3T3 NRU ist der Vergleich der Lebensfähigkeit von Zellen in Anwesenheit oder Abwesenheit von UV/Vis-Bestrahlung, die mit dem Vitalfarbstoff Neutralrot bestimmt wird, einem schwachen kationischen Farbstoff, der leicht Zellmembranen durchdringt und sich intrazellulär in Lysosomen lebensfähiger Zellen anreichert. Die Basiszelllinie ist die Balb/c 3T3-Zelle, ein Mausfibroblast, der 1968 von G.T. Todaro aus Mausembryonen entwickelt wurde. Die Bezeichnung 3T3 steht für „3-Tage-Transfer, Inokulum 3 × 105 Zellen“ in einer 20 cm2-Schale, und diese Zelle ist relativ stabil, leicht verfügbar und einfach zu handhaben (30). Dermaler Fibroblast ist eine der Zielzellen der Phototoxizität, was eine solide Begründung für die Verwendung von 3T3-Zellen liefert.

Um zu entscheiden, ob der Prüfgegenstand im 3T3-NRU-Assay phototoxisch ist oder nicht, muss die Konzentrationsreaktion in Anwesenheit und in Abwesenheit von Bestrahlung ermittelt werden. Es wird der Photo-Irritations-Faktor (PIF) oder der mittlere Photoeffekt (MPE) berechnet (31). PIF ist das Verhältnis von IC50 (Konzentration, die die Lebensfähigkeit der Zellen um 50 % verringert) von nicht bestrahlten zu bestrahlten Zellen, wie in Abb. 7 dargestellt.

Vorhersagemodell der Photozytotoxizität durch PIF (Photoirritationsfaktor).

Wenn die IC50 nicht ermittelt werden kann, wird die MPE nach folgender Gleichung berechnet

PIF < 2 oder eine MPE < 0,1 sagt voraus: „keine Phototoxizität“. Ein PIF > 2 und < 5 oder eine MPE > 0,1 und < 0,15 sagt voraus: „wahrscheinliche Phototoxizität“ und PIF > 5 oder eine MPE > 0,15 sagt voraus: „Phototoxizität“ (Abb. 8).

Berechnung des Photoeffekts: Der Photoeffekt (PEC) bei einer beliebigen Konzentration C ist definiert als das Produkt aus dem Response-Effekt (REC) und dem Dosis-Effekt (DEC), d.h. PEC = REC × DEC. Die Definition wird in Anlehnung an (31) dargestellt. Die Berechnung des Photoeffekts bei der Konzentration 0,4 erfolgt nach den im Text angegebenen Gleichungen: Responseeffekt RE0,4 = (66% – 11%)/100% = 0,55, Dosiseffekt DE0,4 = (0,4/0,16 – 1)/(0,4/0,16 + 1) = 0,43 und Photoeffekt PE0,4 = 0,24. Der mittlere Photoeffekt ergibt sich aus der Mittelung der Werte für den Photoeffekt bei verschiedenen Konzentrationen (31).

Erythrozyten-Hämolysetest. Zellmembranen sind anfällig für photochemisch erzeugte ROS und Radikale. Die UVA-induzierte Schädigung von Erythrozyten und die daraus resultierende Hämolyse (Photohämolyse) wird zur Bewertung des phototoxischen Potenzials von Prüfgegenständen herangezogen (32). Rote Blutkörperchen von Schafen (SRBC) werden mit Chemikalien inkubiert und mit UVA bei 20 J/cm2 bestrahlt. Nach der Bestrahlung wurden die Erythrozyten 2 Stunden lang im Dunkeln bei Raumtemperatur und anschließend 1 Stunde lang bei 37 °C bebrütet. Danach wurde die Hämolyse mit dem Drabkin-Reagenz und die UV-Extinktion bei 540 nm gemessen. Das Ausmaß der Phototoxizität wurde anhand der Freisetzung von Hämoglobin aus SRBC, d.h. der photohämolytischen Aktivität, nach Gleichung (33) bewertet.

• ADE: optische Dichte der exponierten Drogenlösung mit Erythrozyten

• AD: optische Dichte der exponierten Drogenlösung ohne Erythrozyten

• C: Optische Dichte der 100% hämolytischen Kontrolllösung

Phototoxische Wirkstoffe wie Ciprofloxacin, Norfloxacin oder Enoxacin erhöhen die photohämolytische Aktivität bei 100 μg/mL signifikant auf über 20%. Die Empfindlichkeit, Spezifität und Genauigkeit dieses Tests betrugen 67 %, 73 % bzw. 73 % für 24 Chemikalien (8 Duftstoffe, 5 UV-Absorber, 4 Arzneimittel, 4 antimikrobielle Mittel und 3 Farbstoffe) im Vergleich zum In-vivo-Meerschweinchentest (34). Die geringe Empfindlichkeit könnte problematisch sein, und seine Leistung ist der des 3T3-NRU-Tests weit unterlegen, was möglicherweise erklärt, warum dieser Test in letzter Zeit immer weniger verwendet wird.

In vitro humanes 3D-Epidermis-Modell. Um die Einschränkungen der zellbasierten In-vitro-Methoden zu überwinden, wird ein rekonstruiertes 3D-Epidermismodell für die Anwendung bei Phototoxizitätstests untersucht (35,36). Im Grunde ist das Testprinzip ähnlich wie beim 3T3-NRU-Test, nämlich die Bewertung des Unterschieds zwischen der Lebensfähigkeit des Gewebes in Gegenwart und Abwesenheit von UV/VIS-Bestrahlung. Ein ähnliches Vorhersagemodell, das PIF und MPE verwendet, kann verwendet werden (37). Im 3D-Epidermismodell können jedoch wasserunlösliche Stoffe getestet werden, und in den primären Keratinozyten in der Epidermisschicht bleibt ein gewisses Maß an Stoffwechselkapazität erhalten, die auf die Giftstoffe angewendet werden kann, die eine Stoffwechselaktivierung erfordern (38). Darüber hinaus sind Messungen der Zytokinproduktion wie IL-1β (Interleukin-1β) (39), Comet-Assay (40) und histologische Untersuchungen möglich, die bei der weiteren Bewertung der Photoallergenität und Photokarzinogenität berücksichtigt werden können.

In-vivo-Methoden mit Meerschweinchen, Mäusen oder pigmentierten Ratten. Labortiere wie Mäuse und Meerschweinchen werden eingesetzt, um das reale Szenario der menschlichen Phototoxizität zu simulieren. Die Tiere werden topisch oder systemisch Chemikalien ausgesetzt und mit einer angemessenen UVA-Dosis bestrahlt (im Allgemeinen 10 J/cm2 für den Meerschweinchentest und 20 J/cm2 für den Mäusetest (41)). Die Bewertung von Erythem und Ödem auf einer Skala von 0 bis 4 wird addiert, und die maximale Punktzahl während der 72-stündigen Beobachtung wird pro Tier gemittelt, um den Reizungsindex zu ermitteln. Der Phototoxizitätsindex wird durch die Gleichung „Reizungsindex der mit UVA bestrahlten Stelle – Reizungsindex der nicht bestrahlten Stelle“ (42) ermittelt. Ein Phototoxizitätsindex von mehr als 0,6 weist auf eine mögliche Phototoxizität hin. Alternativ kann auch die Ohrdicke gemessen werden, um das Ödem in Mäusetests abzuschätzen. Diese In-vivo-Tests spiegeln den pathophysiologischen Prozess der Phototoxizität beim Menschen gut wider, aber die Opferung von Tieren, die Kosten und der Zeitaufwand für die Durchführung der Tests werfen viele Probleme auf, insbesondere in der Ära des weit verbreiteten Bewusstseins für Tierschutz und Ethik. Um diese Probleme zu überwinden, werden heutzutage Phototoxizitätstests ohne Tierversuche immer beliebter (43).

In-Chemico-Methoden zur Bewertung der Phototoxizität. Zur Bewertung der Phototoxizität wurden zellfreie Reagenzglasmethoden, d.h. In-Chemico-Methoden, erforscht. Informationen über die Lichtabsorption und die Photostabilität von Prüfgegenständen wurden analysiert, um die Phototoxizität vorherzusagen (44). Mit Hilfe der Erzeugung reaktiver Sauerstoffspezies während der Photoanregung und der anschließenden Photoreaktion kann das phototoxische Potenzial einer Chemikalie in chemico bewertet werden (12). Singulett-Sauerstoff wird durch Bleichen mit p-Nitrosodimethylanilin (RNO) nachgewiesen, während der Nitroblau-Tetrazolium-Test (NBT-Formazan-Reaktion) zur Bestimmung der Peroxidbildung verwendet wird, wie unten dargestellt (24),

• Singlet-Sauerstoff + Imidazol

• → → oxidiertes Imidazol

• + RNO

• → RNO-Bleiche + Produkte

Der Test zur Bestimmung der Peroxidbildung zeigte eine Sensitivität und Spezifität von 90% und 76.9% für Kosmetika und 100% und 75% für nicht-kosmetische Chemikalien. Die Aktivität des DNA-Strangbruchs ist eine weitere Möglichkeit, die UV-induzierte Phototoxizität verschiedener Chemikalien oder Medikamente in der Chemie durch Quantifizierung der offenen oder geschlossenen zirkulären DNA zu bewerten. Auch für diesen Test werden keine lebenden Zellen oder Gewebe benötigt, sondern ein Plasmid. Das Plasmid wird in Puffer gelöst und mit den Testartikeln vermischt. Nachdem die Mischung mit UV bestrahlt wurde, werden die Proben einer Elektrophorese unterzogen. Die Menge der gebrochenen DNA wird mit Hilfe einer fluoreszenzbasierten Technologie analysiert. Die UV-induzierte phototoxische Verbindung führt zur Öffnung von DNA-Strängen und ist abhängig von der Wirkstoffkonzentration und der UV-Bestrahlungsdosis (33). Für diese Tests werden keine lebenden Zellen oder Gewebe benötigt, was die Variabilität der Testergebnisse erhöhen kann. Diese Methoden weisen jedoch Einschränkungen auf, zu denen die fehlende Fähigkeit zur Stoffwechselaktivierung, die Unanwendbarkeit auf wasserunlösliche Materialien (Öle, Feststoffe, Gele, formulierte Produkte) und die Unfähigkeit zur Vorhersage der Photogenotoxizität, Photoallergie (Photosensibilisierung) oder Photokarzinogenität gehören. Dieser Test ist auf die Identifizierung von Gefahren beschränkt, nicht auf die Bewertung der phototoxischen Potenz.