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Using NEBcutter
NEBcutter akzeptiert eine Eingabesequenz, die eingefügt, aus einer lokalen Datei entnommen oder als GenBank-Datei vom NCBI über ihre Zugangsnummer abgerufen werden kann. Es stehen verschiedene Optionen zur Verfügung, um die Größe der anzuzeigenden ORFs und den Satz der zu verwendenden Restriktionsenzyme auszuwählen. Das Programm berechnet die Positionen aller Restriktionsenzymstellen, wobei es diejenigen berücksichtigt, die möglicherweise durch überlappende Methylierung blockiert werden könnten, und findet die ORFs in der Sequenz. Es zeigt dann ein schematisches Diagramm der Sequenz, die langen ORFs, basierend auf den in den Methoden beschriebenen Regeln und alle Restriktionsenzyme, die sie nur einmal schneiden. Die anfängliche Anzeige zeigt auch die Enzyme an, die in einem vollständigen Verdau verwendet werden können, um jeden angezeigten ORF zu schneiden. Abbildung 11 zeigt einen typischen Verdau, in diesem Fall eine lineare Ansicht des Plasmids pBR322. Wenn die ursprüngliche DNA-Sequenz zirkulär ist, werden sowohl lineare als auch zirkuläre Darstellungen angeboten. Ausgehend von der anfänglichen Darstellung gibt es viele Möglichkeiten, weiter zu gehen, einschließlich des benutzerdefinierten Verdaus mit Enzymen Ihrer Wahl und verschiedener Darstellungen des Verdaus. Bei der linearen Anzeige ist es auch möglich, einen ausgewählten Bereich der Sequenz zu vergrößern, um eine detailliertere Ansicht zu erhalten. Eine Option ermöglicht die Auswahl einer bestimmten Region und die Anzeige der Enzyme, die in unmittelbarer Nähe dieser Region schneiden. Dies ist nützlich, um Enzyme zu finden, die die gewünschte Region ausschneiden können. Wenn das Zoomen zu einer Region von <60 Nukleotiden führt, wird die eigentliche Sequenz angezeigt (Abb. (Abb.2),2), zusammen mit einer eventuellen Übersetzung, die angemessen ist. Auf dieser Anzeige werden alle Enzyme angezeigt, die die Sequenz schneiden, alle Basen, die Teil einer Erkennungssequenz eines Restriktionsenzyms sind, werden hervorgehoben, und wenn Sie die Maus über den Namen eines Enzyms bewegen, erscheint ein Kasten mit der Erkennungssequenz, und die Sequenz selbst wird in der Anzeige unterstrichen.
Die lineare Anzeige eines Verdaus des Plasmids pBR322. Man beachte, dass die beiden Haupt-ORFs von Stellen flankiert sind (MseI und PflMI; BspHI und EarI), die dazu verwendet werden könnten, sie aus der gesamten Plasmidsequenz herauszuschneiden. In dieser Darstellung werden nur Enzyme gezeigt, die die Sequenz einmal spalten. Optionen für den weiteren Verdau und die Anzeige sind über die Schaltflächen am unteren Rand der Anzeige verfügbar.
Vergrößerte Anzeige einer kurzen Region von pBR322. Beachten Sie, dass die rot und blau hervorgehobenen Basen Teile von Erkennungsstellen für Restriktionsenzyme bilden. Die roten Basen sind eindeutig, während die blauen degenerierte Basen sind. So erkennt BsiEI die Sequenz CGRYCG. Die äußeren CG-Reste sind unveränderlich, während die inneren Basen degeneriert sind und in der dargestellten spezifischen Sequenz GT sind. Die schwarz dargestellten Basen sind nicht Teil einer Erkennungsstelle für Restriktionsenzyme. Diese Anzeige kann nützlich sein, um Restriktionsenzyme zu finden, die in der Lage sind, SNP-Allele zu unterscheiden.
Wenn Sie in der Hauptanzeige die Maus über den Namen eines Restriktionsenzyms bewegen, werden dessen Erkennungssequenz und die genaue Basennummer, an der es spaltet, angezeigt. Wenn mehr als eine Stelle für das Enzym vorhanden ist, werden alle anderen Stellen unterstrichen. Wenn Sie auf den Namen des Enzyms klicken, wird eine Seite mit einer Zusammenfassung von Informationen über das Enzym angezeigt, einschließlich seiner Methylierungsempfindlichkeit, der Art der erzeugten Enden, der verfügbaren Isoschizomere und einer Liste anderer Enzyme, die kompatible Enden erzeugen können. Für NEB-Enzyme werden Informationen über die Verdauungsbedingungen und ein Link zur NEB-Website bereitgestellt.
Ein Hauptmerkmal von NEBcutter ist, dass es alles, was in REBASE über die Methylierungsempfindlichkeit eines der angezeigten Enzyme aufgezeichnet ist, wenn sie eine Dam-Stelle (GATC), eine Dcm-Stelle (CCWGG), eine CpG-Stelle, eine EcoKI-Stelle (AACN6GTGC) oder eine EcoBI-Stelle (TGAN8TGCT) überlappen, berücksichtigt. Wenn theoretische Verdauungen durchgeführt werden, enthalten die Ergebnisse einen Vergleich der Auswirkungen der Methylierung, wobei die Banden hervorgehoben werden, die sich verschieben (Abb. 33).
Eine theoretische Verdauung, die die Auswirkungen einer überlappenden Dcm-Methylierung auf die in der Sequenz vorhandenen MscI-Stellen (Erkennungssequenz: TGGCCA) zeigt, wenn der Bakteriophage Lambda in einem E.coli-Stamm gezüchtet worden wäre, der die Dcm-Methyltransferase (Erkennungssequenz: CCWGG) exprimiert. Fragmente, die von der Dcm-Methylierung betroffen sind, werden in rot dargestellt. Das virtuelle Gel basiert auf der Interpolation einer kubischen Spline-Kurve, die aus experimentellen Daten erzeugt wurde, die mit Fragmenten bekannter Größe produziert wurden.
Auf jeder Seite gibt es Hot-Links, die zur Hauptseite zurückführen, Hilfe bei der Interpretation der Anzeige bieten oder es den Benutzern ermöglichen, Kommentare an die Autoren zu senden. Die Benutzeroberfläche wurde so gestaltet, dass sie so intuitiv wie möglich ist und einen einfachen Zugang zu den wichtigsten Funktionen bietet, die für Forscher nützlich sind, die versuchen, ihre DNA zu spalten. Die aktuelle Version von NEBcutter hat mehr als 400 000 Sequenzen von Nutzern verarbeitet. Wir bereiten derzeit eine Reihe von Verbesserungen an NEBcutter vor, und die Version 2.0 soll bis zum 1. Juli veröffentlicht werden.