Das zentrale Dogma der Molekularbiologie lautet DNA→RNA→Protein. Um ein bestimmtes Protein zu synthetisieren, muss die DNA zunächst in Boten-RNA (mRNA) umgeschrieben werden. mRNA kann dann am Ribosom in Polypeptidketten übersetzt werden, die die Primärstruktur der Proteine bilden. Die meisten Proteine werden dann durch eine Reihe von posttranslationalen Modifikationen wie Proteinfaltung, Bildung von Disulfidbrücken, Glykosylierung und Acetylierung modifiziert, um funktionelle, stabile Proteine zu schaffen. Proteinexpression bezieht sich auf den zweiten Schritt dieses Prozesses: die Synthese von Proteinen aus mRNA und das Hinzufügen von posttranslationalen Modifikationen

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Forscher verwenden verschiedene Techniken, um die Proteinexpression für experimentelle, biotechnologische und medizinische Anwendungen zu kontrollieren. Forscher können Proteine in vivo sichtbar machen, indem sie sie mit fluoreszierenden Proteinen markieren, um ihre Lokalisierung zu untersuchen, oder Proteine reinigen, um ihre Struktur, Wechselwirkungen und Funktionen zu untersuchen. Proteine können auch zur Verwendung in der molekularbiologischen Forschung (z. B. Polymerasen und andere Enzyme können gereinigt und zur Manipulation von DNA verwendet werden) oder in der Medizin (z. B. Insulin) gereinigt werden.

Im Gegensatz zu DNA, die relativ leicht synthetisiert werden kann, müssen Proteine mit Hilfe komplexer Mischungen aus Zellen oder unter Verwendung lebender Zellen hergestellt werden. Es gibt mehrere Arten von Expressionssystemen, die für die Proteinproduktion und -reinigung verwendet werden. Dazu gehören Säugetier-, Insekten-, Bakterien-, Pflanzen-, Hefe- und zellfreie Expressionssysteme.

Im Großen und Ganzen besteht die allgemeine Strategie für die Proteinexpression darin, Zellen mit der DNA-Vorlage Ihrer Wahl zu transfizieren und diese Zellen Ihr gewünschtes Protein transkribieren, übersetzen und modifizieren zu lassen. Die modifizierten Proteine können dann mit Hilfe von Protein-Tags aus den lysierten Zellen extrahiert und mit verschiedenen Reinigungsmethoden von Verunreinigungen getrennt werden. Die Entscheidung, welches Expressionssystem verwendet werden soll, hängt von mehreren Faktoren ab:

1. Das Protein, das Sie zu exprimieren versuchen
2. Wie viel Protein Sie benötigen
3. Ihre Pläne für nachgeschaltete Anwendungen

In diesem Blog-Beitrag fassen wir einige der gebräuchlichsten Expressionssysteme zusammen, einschließlich ihrer Vorteile und Vorbehalte, die Sie bei der Auswahl eines Systems beachten sollten.

Säugetier-Expressionssysteme

Säugetierzellen sind ein ideales System für die Expression von Säugetierproteinen, die für eine ordnungsgemäße Proteinfunktion mehrere Posttranslationsmodifikationen benötigen. Die meisten DNA-Konstrukte, die für die Expression in Säugetieren entwickelt wurden, verwenden virale Promotoren (SV40, CMV und RSV) für eine robuste Expression nach der Transfektion. Säugetiersysteme können Proteine sowohl transient als auch über stabile Zelllinien exprimieren. Beide Methoden liefern hohe Proteinausbeuten, wenn die Transfektion erfolgreich ist.

Einige Säugetiersysteme ermöglichen auch die Kontrolle darüber, wann ein Protein exprimiert wird, durch die Verwendung von konstitutiven und induzierbaren Promotoren. Induzierbare Promotoren sind äußerst nützlich, wenn ein gewünschtes Proteinprodukt in hohen Konzentrationen toxisch für Zellen ist. Trotz ihrer Vorteile erfordern Expressionssysteme für Säugetiere im Vergleich zu anderen Systemen anspruchsvolle Zellkulturbedingungen.

Insektenexpressionssysteme

Insektenzellen können auch zur Herstellung komplexer eukaryotischer Proteine mit den richtigen posttranslationalen Modifikationen verwendet werden. Es gibt zwei Arten von Insektenexpressionssystemen: mit Baculovirus infizierte und nichtlytische Insektenzellen.

Baculovirus-Expressionssysteme sind sehr leistungsfähig für die Expression rekombinanter Proteine auf hohem Niveau. Diese Systeme ermöglichen eine hohe Expression von sehr komplexen, glykosylierten Proteinen, die in E. coli- oder Hefezellen nicht hergestellt werden können. Das einzige Problem bei Baculovirus-Systemen ist, dass die infizierte Wirtszelle schließlich lysiert wird. Die Zelllyse stoppt die Proteinproduktion, aber es gibt auch nicht-lytische Expressionssysteme für Insektenzellen (sf9-, Sf21-, Hi-5-Zellen), die eine kontinuierliche Expression von in das Genom der Insektenzellen integrierten Genen ermöglichen. Beide Arten von Insektenexpressionssystemen können für die Produktion großer Mengen von Proteinen skaliert werden.

Zu den Nachteilen von Insektenzell-Expressionssystemen gehört, dass die Virusproduktion recht zeitaufwendig sein kann und dass Insektenzellen anspruchsvolle Kulturbedingungen erfordern, die denen von Säugetier-Expressionssystemen ähneln.

Bakterielle Expressionssysteme

Wenn man schnell und kostengünstig große Mengen an Proteinen produzieren will, ist eine bakterielle Wirtszelle fast immer die Antwort. E. coli ist zweifellos einer der beliebtesten Wirte für die Proteinexpression mit mehreren Stämmen, die auf die Proteinexpression spezialisiert sind. Die Proteinexpression in Bakterien ist recht einfach: DNA, die für das gewünschte Protein kodiert, wird in einen Plasmid-Expressionsvektor eingefügt, der dann in eine Bakterienzelle transformiert wird. Die transformierten Zellen vermehren sich, werden zur Produktion des gewünschten Proteins angeregt und anschließend lysiert. Das Protein kann dann aus den Zelltrümmern gereinigt werden.

Es gibt mehrere gängige DNA-Vektoren, die für die Produktion großer Proteinmengen in Bakterienzellen verwendet werden können: die Vektoren pET, pRSET, Gateway pDEST und pBAD zum Beispiel. Die Proteinexpression wird bei jedem dieser Vektoren durch einen anderen Promotor gesteuert, was zu unterschiedlichen Expressionsniveaus führt; eine geringere Expression kann erforderlich sein, wenn Ihr Protein für E. coli toxisch ist. Von allen Vektoren liefert pET unter der Kontrolle des T7-Lac-Promotors und induziert durch Laktose den höchsten Grad an Proteinexpression.

Trotz ihrer einfachen Verwendung ist es wichtig zu beachten, dass Bakterien in der Regel keine funktionellen Multidomänen-Säugerproteine produzieren können, da Bakterienzellen nicht in der Lage sind, geeignete posttranslationale Modifikationen vorzunehmen. Darüber hinaus werden viele von Bakterien produzierte Proteine unlöslich und bilden Einschlusskörper, die ohne scharfe Reagenzien und viel Geduld nur schwer zu extrahieren sind.

Pflanzenexpressionssysteme

Pflanzen bieten eine kostengünstige und technisch einfache Möglichkeit der Massenexpression rekombinanter Proteine. Viele Zellen aus verschiedenen Pflanzenarten wie Mais, Tabak, Reis, Zuckerrohr und sogar Kartoffelknollen wurden für die Proteinexpression verwendet.

Pflanzensysteme weisen viele der gleichen Merkmale und Verarbeitungsanforderungen auf wie Expressionssysteme in Säugetierzellen, einschließlich der meisten komplexen post-translationalen Modifikationen. Die Extraktion und Reinigung rekombinanter Proteine aus Pflanzen kann jedoch teuer und zeitaufwendig sein, da Pflanzengewebe selbst biochemisch komplex ist.

Um diese Probleme zu umgehen, haben sich Wissenschaftler die natürliche Sekretion von Biochemikalien und Proteinen durch Pflanzenwurzeln zunutze gemacht. Die Markierung rekombinanter Proteine mit einem natürlich sezernierten Pflanzenpeptid erleichtert den Zugang und die Reinigung des gewünschten Proteins. Obwohl es sich um eine relativ neue Technologie handelt, wurden Pflanzenzellen bereits zur Expression einer Vielzahl von Proteinen verwendet, darunter Antikörper und Arzneimittel, insbesondere Interleukine.

Hefeexpressionssysteme

Hefe ist ein hervorragendes Expressionssystem zur Erzeugung großer Mengen rekombinanter eukaryotischer Proteine. Obwohl viele Hefearten für die Proteinexpression verwendet werden können, ist S. cerevisiae die zuverlässigste und am häufigsten verwendete Art, da sie als Modellorganismus in der Genetik und Biochemie verwendet wird.

Bei der Verwendung von S. cerevisiae stellen Forscher rekombinante Proteine häufig unter die Kontrolle des Galaktose-induzierbaren Promotors (GAL). Andere häufig verwendete Promotoren sind die phosphat- und kupferinduzierbaren PHO5- bzw. CUP1-Promotoren. Hefezellen werden in wohldefinierten Medien gezüchtet und können leicht an die Fermentation angepasst werden, was eine stabile Produktion von Proteinen in großem Maßstab ermöglicht.

Im Allgemeinen sind Hefeexpressionssysteme einfacher und billiger zu handhaben als Säugetierzellen und können im Gegensatz zu bakteriellen Systemen oft komplexe Proteine modifizieren. Hefezellen wachsen jedoch langsamer als bakterielle Zellen, und die Wachstumsbedingungen müssen oft optimiert werden. Hefezellen sind auch dafür bekannt, dass sie Proteine hyperglykosylieren, was je nach dem gewünschten Protein ein Problem darstellen kann.

Zellfreie Expressionssysteme

In zellfreien Expressionssystemen werden Proteine in vitro unter Verwendung gereinigter Komponenten der Transkriptions- und Translationsmaschinerie zusammengesetzt. Dazu gehören Ribosomen, RNA-Polymerase, tRNAs, Ribonukleotide und Aminosäuren. Zellfreie Expressionssysteme sind ideal für den schnellen Aufbau von mehr als einem Protein in einer Reaktion. Ein großer Vorteil dieser Systeme ist ihre Fähigkeit, Proteine mit markierten oder modifizierten Aminosäuren zu assemblieren, die in verschiedenen nachgeschalteten Anwendungen nützlich sind. Zellfreie Expressionssysteme sind jedoch teuer und technisch sehr anspruchsvoll in der Anwendung.

Alyssa D. Cecchetelli ist Wissenschaftlerin bei Addgene. Sie hat an der Northeastern University promoviert und interessiert sich besonders für Zellsignale und Kommunikation. Sie liebt es, der wissenschaftlichen Gemeinschaft beim Austausch von Plasmiden zu helfen.

Zusätzliche Ressourcen

• Thermofisher Protein Expression Systems
• Rekombinante Proteinexpression in Escherichia coli: Fortschritte und Herausforderungen
• Produktion rekombinanter Proteine in Pflanzenwurzelexsudaten