Użyteczność kwasów organicznych produkowanych przez Exiguobacterium sp. 12/1 w neutralizacji alkalicznych ścieków
Abstract
Celem pracy było zbadanie roli kwasów organicznych produkowanych przez Exiguobacterium sp. szczep 12/1 (DSM 21148) w neutralizacji alkalicznych ścieków pochodzących z przemysłu napojów. Bakteria ta jest zdolna do wzrostu w podłożu o pH aż do pH 12,0 oraz do neutralizacji alkalicznych ścieków przemysłowych od pH 12,0 do pH 7,5. Wstępne badania rodzaju grup funkcyjnych obecnych w podłożu, przeprowadzone przy użyciu spektroskopii FT-IR, wykazały obecność pików odpowiadających grupie karbonylowej i grupie hydroksylowej, co sugeruje uwalnianie kwasu karboksylowego lub związanego z nim produktu(ów) metabolicznego(ych). Identyfikacja specyficznej grupy karboksylowej, przeprowadzona metodą RP-HPLC, wykazała obecność pojedynczego piku w supernatancie hodowli o czasie retencji najbardziej zbliżonym do kwasu mrówkowego. Stężenie kwasu produkowanego na różnych źródłach węgla badano w funkcji czasu. Pomimo, że kwas występował w tym samym stężeniu końcowym, szybkość produkcji kwasu była największa w przypadku podłoża z dodatkiem sacharozy, a następnie fruktozy i glukozy. Poznanie produktów metabolicznych bakterii można uznać za pierwszy krok w kierunku wykorzystania jej potencjału do bioremediacji na dużą skalę alkalicznych ścieków z przemysłu napojowego.
1. Wprowadzenie
Alkalifile – mikroorganizmy, które mają optima pH dla wzrostu przy lub powyżej pH 9 – wywarły wielki wpływ w zastosowaniach przemysłowych. Biologiczne detergenty zawierają enzymy, takie jak alkaliczne celulazy i/lub alkaliczne proteazy, które zostały wyprodukowane z alkalifili. Alkalia są również wykorzystywane do przemysłowej produkcji enzymów, które mogą mieć konkretne zastosowanie, na przykład cyklodekstryny przez alkaliczną glukanotransferazę cyklomaltodekstryny i alkaliczną aktywną α-amylazę tworzącą maltoheksaozę, które znajdują zastosowanie w przemyśle spożywczym, chemicznym i farmaceutycznym. Stwierdzono, że celuloza drzewna poddana działaniu alkaliów może być biologicznie wybielana przez ksylanazy produkowane przez alkalifile. Fujiwara i współpracownicy opisali zastosowanie alkalicznej proteazy do rozkładu galaretowatej powłoki błon rentgenowskich, z których odzyskano srebro. Alkalifile udowodniły również swój potencjał w biodegradacji różnych związków organicznych .
Tak więc, bakterie alkalifilne wzbudziły duże zainteresowanie ze względu na ich enzymy zewnątrzkomórkowe i właściwości biochemiczne, takie jak alkalifilia i stabilność alkaliczna. Ich bioenergetyka została również szczegółowo zbadana, natomiast niewiele wiadomo o ich fizjologii, na przykład o enzymach wewnątrzkomórkowych i metabolitach. Cechy pośredniego procesu metabolicznego są ważne, ponieważ pomagają w scharakteryzowaniu bakterii, jej składu enzymatycznego, etapu metabolicznego komórek i możliwości inżynierii metabolicznej. Zdolność alkalifili do silnej fluktuacji pH podłoża zawierającego węglowodany została wykorzystana w poprzedniej pracy do neutralizacji silnie alkalicznych ścieków pochodzących z przemysłu napojowego przy użyciu Exiguobacterium sp. szczep 12/1. Rodzaj Exiguobacterium należy do rzędu Bacillales, który obejmuje również członków rodzaju Bacillus. Exiguobacterium sp. 12/1 jest fakultatywnym alkalifilem, który rośnie optymalnie przy pH 10 i jest zdolny do neutralizacji alkalicznych ścieków, aby obniżyć je z pH 12.0 do pH 7.5. Zakłada się, że bakteria uwalnia kwaśne produkty przemiany materii w celu zneutralizowania silnie zasadowego środowiska zewnętrznego. Ważne jest jednak, aby scharakteryzować rodzaj metabolitów uwalnianych do środowiska zewnątrzkomórkowego. Tutaj badamy produkcję kwasów organicznych jako możliwy mechanizm neutralizacji alkaliów. Tego typu badania będą niezbędne przed opracowaniem na szeroką skalę zastosowań bakterii do neutralizacji alkalicznych ścieków z przemysłu napojowego.
Głównym źródłem węgla w ściekach z przemysłu napojów bezalkoholowych jest sacharoza (dwucukier zawierający glukozę i fruktozę), która jest również głównym czynnikiem wpływającym na biochemiczne zapotrzebowanie tlenu (BZT). Średnie BZT ścieków z przemysłu napojów bezalkoholowych waha się od 600 do 4500 mg/L, co odpowiada 673-5052 ppm sacharozy. Przegląd literatury na temat produktów metabolicznych dużej liczby bakterii rosnących na cukrach prostych sugeruje, że bakterie mogą wykorzystywać te cukry proste do generowania kwasów organicznych. Potwierdza to również analiza pozakomórkowych produktów metabolicznych innych alkalifilnych gatunków Bacillus. W badaniach tych stwierdzono, że głównym kwasem organicznym produkowanym przy źródle węgla sacharoza jest kwas octowy. Kwas mrówkowy jest częstym metabolitem bakterii neutrofilnych w warunkach beztlenowych, natomiast B. circulans var. alkalophilus wytwarza go w ilości do 2 g/L nawet w hodowlach tlenowych. Inne kwasy lotne, takie jak propionowy, masłowy, izomasłowy i izowalerianowy, są typowe dla szczepów Bacillus alcalophilus ssp. halodurans, B. alcalophilus i Bacillus sp. 17-1. Kwasy izomasłowy i izowalerianowy zostały odnotowane w pożywkach kilku pałeczek neutrofilnych. Jednak te kwasy, jak również kwas propionowy i masłowy, są uważane za pochodzące z aminokwasów na podstawie badań nad Clostridium sp. Kwasy mlekowy i pirogronowy są dość powszechnie produkowane przez pałeczki neutrofilne, ale produkcja kwasu bursztynowego przez Bacillus jest rzadka. Etanol nie został wykryty u pałeczek alkalifilnych, mimo że jest on typowym produktem glukozowych hodowli wielu pałeczek neutrofilnych. Tak więc alkaliczne warunki wzrostu mogą wpływać na produkcję neutralnych metabolitów. W niniejszej pracy zastosowaliśmy wysokosprawną chromatografię cieczową w fazie odwróconej do zbadania rodzaju i stężenia kwasów produkowanych przez Exiguobacterium sp. szczep 12/1 podczas neutralizacji podłoża o wysokim pH zawierającego różne rodzaje źródeł węgla.
2. Materiały i Metody
2.1. Szczep i warunki hodowli
Hodowla Exiguobacterium sp. 12/1 została uzyskana z DSMZ (DSM 21148) i była utrzymywana w postaci zapasów glicerolu. Alkaliczne podłoże podstawowe (ABM) zawierające (wszystkie stężenia w g/L): pepton, 1; ekstrakt drożdżowy, 0,5; glukoza, 1; K2HPO4, 0,1; Na2CO3, 1; pH 10 (trzy ostatnie składniki dodawane do autoklawowanego podłoża z oddzielnie sterylizowanych roztworów) było używane do rutynowej hodowli szczepu 12/1 w temperaturze 37°C. Do analiz IR i RP-HPLC bakterię hodowano w 37°C, 200 rpm w minimalnym podłożu solnym (MSM) zawierającym (wszystkie stężenia w mM): K2HPO4, 10; KH2PO4, 10; MgSO4-7H2O, 1; sól disodową EDTA, 0,3; ZnSO4-7H2O, 0,01; MnSO4, 0,02; CuSO4-5H2O, 0,004; FeSO4-7H2O, 0,1; NaMoO4-2H2O, 0.004; (NH4)2SO4, 5 i 1% (w/v) jednego z następujących węglowodanów: glukozy, fruktozy lub sacharozy (wszystkie składniki dodawano z oddzielnie autoklawowanych stężonych roztworów podstawowych). Ostateczne pH pożywki dostosowano do 10,5 przy użyciu 1 N NaOH.
2.2. Analiza wzrostu i pH hodowli
1 mL hodowli w fazie log na ABM użyto do inokulacji prekultur (50 mL) (MSM zawierający 1% cukru). Właściwą kulturę testową (250 mL MSM w 500 mL kolbie Erlenmeyera) zaszczepiono całą prekulturą w połowie fazy log (O.D. ~ 1.2). Każdy zestaw hodowlany składał się z trzech kolb. Absorbancja próbek przy 650 nm była miarą wzrostu bakterii. pH oznaczano w próbkach hodowli bezkomórkowych w temperaturze pokojowej po odwirowaniu 4000 ×g przez 20 min.
2.3. Analiza FT-IR
Hodowle zbierano po 60 h wzrostu i odwirowywano przy 4000 ×g przez 20 min. Do analizy IR, supernatant z hodowli był liofilizowany i rozdrabniany do postaci sproszkowanej. Sproszkowany supernatant został następnie zmieszany z bromkiem potasu, a mieszaninę sprasowano do postaci tabletki. Na koniec tabletkę analizowano za pomocą spektrometru FT/IR-4200 (JASCO, Tokio, Japonia).
2.4. Analiza RP-HPLC
Hodowla była zbierana w różnych punktach czasowych i odwirowywana przy 4000 ×g przez 20 min. Do analizy HPLC supernatant hodowli filtrowano przez filtr 0,22 μm, a 10 μL przefiltrowanej próbki wstrzykiwano do kolumny HPLC.
Analityczny kwas mrówkowy klasy standardowej, kwas octowy, kwas bursztynowy, kwas propionowy, kwas mlekowy i kwas izomasłowy uzyskano z firmy Sigma. Przygotowano podstawowe roztwory wzorcowe (100 mg/mL lub 100 μL/mL) i przechowywano je w temperaturze 4°C do dalszego użycia. Robocze roztwory wzorcowe (10 mg/mL lub 10 μL/mL) przygotowywano codziennie. Woda Milli-Q (Millipore) była używana do przygotowania roztworów buforowych i roztworów podstawowych każdego związku i próbek. Roztwory podstawowe, próbki i bufor były filtrowane przez celulozowe filtry membranowe Whatman (0.45 μm, Whatman, Clifton, NJ, USA). Przed użyciem rozpuszczalniki odgazowywano w próżni.
Analizę kwasów organicznych przeprowadzono zgodnie z metodą Tormo i Izco . Analizę przeprowadzono w systemie Breeze (Waters, Mildford, MA, USA) składającym się z binarnej pompy HPLC 1525, autosamplera 717 plus i dwukanałowego detektora UV 2487 ustawionego na 210 nm, obsługiwanego za pomocą oprogramowania Breeze. Rozdziału dokonano na kolumnie Atlantis dC18 (Waters) 250 × 4,6 × 5 μm. Codziennie przygotowywano 20 mM NaH2PO4 dostosowanego do pH 2,20 za pomocą kwasu fosforowego i filtrowano przez membrany hydrofilowe 0,2 μm (Millipore). W programie rozpuszczalnikowym wykorzystano dwa zbiorniki zawierające 1% acetonitryl w 20 mM buforze fosforanowym dostosowanym do pH 2,20 z kwasem fosforowym (rozpuszczalnik A) i acetonitryl (rozpuszczalnik B); szybkość przepływu ustalono na 1,5 mL/min w temperaturze pokojowej. Program gradientowy rozpoczęto od 100% rozpuszczalnika A, a po 7 min rozpuszczalnik B zwiększano liniowo do osiągnięcia 7% w ciągu 5 min. Od 12 do 19 min tempo utrzymywano na poziomie 93% rozpuszczalnika A i 7% rozpuszczalnika B. Następnie tempo zmieniano na warunki wyjściowe, aby zrównoważyć kolumnę przez 15 min przed ponowną iniekcją 10 μL kolejnej próbki.
3. Wyniki
3.1. Analiza neutralizacji na pożywce zdefiniowanej
Do analizy kwasu organicznego produkowanego przez bakterię wybrano pożywkę z minimalną ilością soli ze względu na jej zdefiniowany charakter i podobne źródło węgla jak w przypadku ścieków z przemysłu napojowego. Bakteria mogła rosnąć w podłożu z minimalną zawartością soli uzupełnionym różnymi źródłami węgla: glukozą, fruktozą i sacharozą. Rysunek 1 przedstawia profil wzrostu i charakterystykę pH pożywki w czasie. Fruktoza i sacharoza powodowały znacznie szybszą neutralizację pożywki w porównaniu do glukozy. Końcowe pH uzyskane przy zastosowaniu glukozy było również nieco wyższe niż w przypadku pożywki suplementowanej sacharozą i fruktozą. Znalazło to również odzwierciedlenie w profilu wzrostu bakterii hodowanych na trzech źródłach węgla. Bakterie rosły szybciej na sacharozie, a następnie na fruktozie i glukozie.
(a)
(b)
(a)
(b)
Wariantność pH (a) i O.D. (b) z czasem na MOM. Wartości przedstawiają średnią z trzech powtórzonych pomiarów, a słupki błędów – odchylenie standardowe.
3.2. Identification of Functional Group Present in the Culture Supernatant
Aby zidentyfikować szeroką grupę funkcyjną metabolitu produkowanego przez bakterię w celu neutralizacji alkalicznych ścieków, liofilizowany supernatant hodowli poddano spektroskopii FT-IR. W widmie obecne były dwa piki odpowiadające grupie karbonylowej (przy 1644,98 cm-1) i grupie hydroksylowej (przy 3436,74 cm-1) (Tabela 1). Jak wynika z przeglądu literatury, bakteria ta najprawdopodobniej wytwarza kwasy organiczne jako produkt metaboliczny, który neutralizuje alkaliczne ścieki.
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||
3.3. Identyfikacja specyficznego produktu metabolicznego bakterii
W celu identyfikacji kwasu organicznego produkowanego przez bakterię, wykonano HPLC z odwróconą fazą z wykorzystaniem znanych wzorców kwasów organicznych wybranych na podstawie przeglądu literatury. Standardy były badane zarówno pojedynczo (Rysunek 2(a)) jak i w mieszaninie (Rysunek 2(b)) w celu ustalenia różnic w czasie retencji wynikających z interferencji innych kwasów organicznych w medium. Stwierdzono, że RT standardowych kwasów organicznych w obu przypadkach jest podobny, a różnica w czasie retencji nie przekracza 0,09 jednostki, z wyjątkiem kwasu propionowego (Tabela 2). Supernatant hodowlany analizowano tą samą metodą i stwierdzono, że składa się on z pojedynczego piku o czasie retencji podobnym do kwasu mrówkowego. Zostało to dodatkowo potwierdzone przez dodanie do supernatantu standardowego kwasu mrówkowego, którego pik nakładał się z pikiem produktu w supernatancie (rysunek 2 d)).
|
||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
(a)
(b)
(c)
(d)
(a)
(b)
(c)
(d)
RP-.Chromatogramy HPLC poszczególnych wzorcowych kwasów organicznych (a), standardowych kwasów organicznych w mieszaninie (b), supernatantu hodowli (c) i supernatantu hodowli z dodatkiem kwasu mrówkowego.
3.4. Analiza ilościowa produktu metabolicznego bakterii
Do analizy ilościowej supernatantu hodowli wykorzystano różne standardowe stężenia kwasu mrówkowego i obliczono powierzchnię piku odpowiadającą każdemu stężeniu. Powierzchnię piku wykreślono w stosunku do stężenia w celu uzyskania krzywej standardowej (rysunek 3). Ta krzywa standardowa została użyta do obliczenia ilości kwasu produkowanego w czasie na podłożu z minimalną zawartością soli, uzupełnionym różnymi źródłami węgla. Supernatant hodowli bakterii był analizowany w sposób zależny od czasu i ponownie poddany analizie HPLC z odwróconą fazą. Stwierdzono, że pik głównego produktu w supernatancie hodowli bakteryjnej wzrasta wraz z upływem czasu. Czas retencji kwasu jest podobny do czasu retencji kwasu mrówkowego. Badanie ilości kwasu mrówkowego wytworzonego przy użyciu różnych źródeł węgla w funkcji czasu przedstawiono na rysunku 4. Największa ilość kwasu została wytworzona w przypadku MOM uzupełnionego sacharozą, a następnie fruktozą i glukozą.
Krzywa standardowa do oznaczania stężenia kwasu mrówkowego w supernatancie hodowli.
Zmienność ilości kwasu organicznego produkowanego w czasie na MOM suplementowanym różnymi źródłami węgla. Wartości reprezentują średnią z trzech powtórzeń pomiarów, a słupki błędów przedstawiają odchylenie standardowe.
4. Dyskusja
Głównym źródłem węgla w ściekach z przemysłu napojów jest sacharoza. Dlatego do analizy produktu metabolicznego powstającego podczas neutralizacji wybrano dobrze zdefiniowane podłoże z minimalną zawartością soli, zawierające sacharozę oraz dwa składowe cukry proste – glukozę i fruktozę. Charakterystyka wzrostu szczepu 12/1 na minimalnym podłożu solnym uzupełnionym trzema źródłami węgla wskazuje na wydajną neutralizację towarzyszącą wzrostowi (rys. 1(a) i 1(b)). Spadek pH pożywki wzrostowej jest z konieczności spowodowany albo tworzeniem się kwasów, albo usuwaniem zasad.
Produkcja kwasów jest dobrze udokumentowana w przypadku bakterii hodowanych na cukrach prostych. Produkty metaboliczne niektórych alkalifilnych bakterii z rodzaju Bacillus zostały przebadane. W badaniach tych stwierdzono, że głównym kwasem organicznym produkowanym na sacharozie jest kwas octowy. Sekwencje genomu alkalifilnych gatunków Bacillus – Bacillus pseudofirmus OF4, Bacillus halodurans i Bacillus clausii – również potwierdzają tę obserwację, ponieważ wszystkie te gatunki posiadają funkcjonalną ścieżkę konwersji pirogronianu do octanu. Kwas mrówkowy jest powszechnym metabolitem bakterii neutrofilnych w warunkach beztlenowych, podczas gdy B. circulans var. alkalophilus wytwarza go do 2 g/L nawet w hodowlach tlenowych. Inne kwasy lotne, takie jak propionowy, masłowy, izomasłowy i izowalerianowy są typowe dla szczepów Bacillus alcalophilus ssp. halodurans, B. alcalophilus i Bacillus sp. 17-1. Kwasy izomasłowy i izowalerianowy zostały odnotowane w pożywkach kilku pałeczek neutrofilnych. Jednak te kwasy, jak również kwas propionowy i masłowy, są uważane za pochodzące z aminokwasów na podstawie badań nad Clostridium sp. Kwasy mlekowy i pirogronowy są dość powszechnie produkowane przez pałeczki neutrofilne, ale produkcja kwasu bursztynowego przez Bacillus jest rzadka. Etanol nie został wykryty u pałeczek alkalifilnych, chociaż jest on typowym produktem glukozowych hodowli wielu pałeczek neutrofilnych. Tak więc zasadowe warunki wzrostu mogą wpływać na produkcję neutralnych metabolitów.
Wstępne badania produktów metabolizmu w przypadku Bacillus sp. zostały przeprowadzone przy użyciu procedury miareczkowej. Zwiększona zdolność buforowania supernatantu hodowli bakteryjnej w okolicach pH 5, które jest typowym zakresem protonowania kwasów karboksylowych, posłużyła do wysunięcia hipotezy, że pożywka zawiera kwasy karboksylowe. W tym badaniu zastosowaliśmy spektroskopię FT-IR w celu określenia grupy funkcyjnej związku(ów) obecnego(ych) w supernatancie hodowli. Spektrograf FT-IR pokazał piki charakterystyczne dla grupy karbonylowej (przy 1644,98 nm) i grupy hydroksylowej (przy 3436,74 nm) (Tabela 1), co sugeruje obecność gatunku chemicznego składającego się z grupy hydroksylowej i karbonylowej i najprawdopodobniej jest to kwas karboksylowy.
Metoda HPLC z fazą odwróconą została użyta do analizy kwasów organicznych obecnych w supernatancie hodowli. Warunki HPLC zostały dobrane tak, aby uzyskać najlepszą rozdzielczość, czyli pH 2,2 i 1% acetonitryl. Metoda HPLC z odwróconą fazą jest korzystna ze względu na zastosowanie tańszych kolumn, łatwiejsze manipulowanie parametrami analitycznymi w celu optymalizacji rozdziału oraz analizy w temperaturze pokojowej. Metodę zastosowano najpierw do obliczenia czasu retencji wzorców kwasów wybranych na podstawie przeglądu literatury. Kolejność elucji kwasów w tych warunkach była taka sama, jak podana w pracy Tormo i Izco, ale wystąpiły różnice w czasach retencji obserwowanych w tym badaniu i tych podanych w pracy Tormo i Izco. Różnica ta może być przypisana różnicy w warunkach HPLC, takich jak temperatura 25-30°C w tym badaniu w porównaniu z 24°C ± 1°C podaną w Tormo i Iczo .
Maksymalny spadek jednostek pH występujący w jednostce czasu odnotowany do tej pory u bakterii alkalifilnych wynosi 0,13 jednostek na godzinę w przypadku Bacillus circulans var. alkalophilus, co jest dość niską wartością w porównaniu z ponad dwukrotnym spadkiem jednostek podczas początkowej 1 h inokulacji odnotowanym w niniejszej pracy. Duży spadek pH wskazuje na tworzenie się kwaśnych produktów katabolizmu. Jednakże, samo tempo spadku pH nie wskazuje na wzrost stężenia kwasów. Dlatego też przeprowadzono analizę ilościową produktów metabolizmu bakterii przy użyciu RP-HPLC. HPLC była preferowana zamiast GC, ponieważ porównanie metod GC i HPLC do oznaczania kwasów organicznych w supernatantach hodowli bakterii alkalofilnych sugeruje, że podczas gdy rozdzielczość kwasów przez GLC była doskonała, ilościowa odtwarzalność przez HPLC była lepsza niż GLC. Zgodnie z oczekiwaniami, stężenie wytworzonego kwasu wzrastało wraz z wydłużeniem czasu inkubacji (Rysunek 4). W rzeczywistości, ilość kwasu nadal wzrastała po osiągnięciu minimalnego pH. Jest to zgodne z wcześniejszymi badaniami produkcji kwasu w przypadku fakultatywnych i obligatoryjnych alkalifilnych Bacillus sp., gdzie produkcja kwasu wzrastała nawet 30 h po osiągnięciu minimalnego pH. Analiza porównawcza produktów metabolicznych wytwarzanych w podłożach z różnymi źródłami węgla wykazała, że pomimo obecności kwasu w tym samym stężeniu końcowym, szybkość produkcji kwasu była największa w przypadku podłoża z sacharozą, a następnie fruktozą i glukozą (rys. 4). Jest to zgodne z charakterystyką wzrostu organizmów w podłożach uzupełnionych tymi cukrami.
5. Podsumowanie
Exiguobacterium sp. szczep 12/1 neutralizuje pH środowiska zewnętrznego poprzez produkcję krótkołańcuchowego kwasu organicznego – kwasu mrówkowego. Mając na uwadze potencjalne zastosowanie bioremediacji na dużą skalę ścieków alkalicznych, zdolność bakterii do neutralizacji zasad w ściekach z przemysłu napojowego może być uważana za pierwszy krok w kierunku wykorzystania jej potencjału komercjalizacji.
Podziękowania
N. M. Kulshreshtha dziękuje University Grants Commission za stypendium badawcze. Autorzy są niezmiernie wdzięczni Radzie Badań Naukowych i Przemysłowych, Indie, za zapewnienie platformy R&D i udogodnień dla tych badań.
.