γδ-selection

γδT cells emerge from DN thymocytes, as the rearrangement of the TCRγ and δ chains occurs in the DN stages . Komórki prekursorowe γδ, które mają rearanżację TCRγ i δ przed rekombinacją TCRβ, wyrażają kompleks γδTCR/CD3 na błonie plazmatycznej, gdzie γδTCR samooligomeryzuje, jak pre-TCR, i inicjuje wewnątrzkomórkowe szlaki sygnałowe . Ten sygnał γδTCR indukuje proces określany jako „selekcja γδ”, który potwierdza wytworzenie funkcjonalnych łańcuchów TCRγδ, dzięki czemu komórka rozpoznaje, że „jestem komórką γδT” .

Sygnał selekcji γδ uruchamia różnicowanie z komórek prekursorowych γδ CD5- CD24high do komórek CD5+ CD24low γδT-committed . Przejście z komórek CD5- do CD5+ γδT jest znacznie upośledzone u myszy z niedoborem Syk, podczas gdy myszy z niedoborem Zap70 wykazują normalne różnicowanie komórek CD5+ γδT. Myszy z podwójnym niedoborem Zap70/Syk wykazują całkowite zatrzymanie różnicowania komórek γδT na etapie prekursora CD5-. Tak więc selekcja γδ jest głównie zależna od sygnału mediowanego przez Syk, a Zap70 odgrywa jedynie niewielką i redundantną rolę w tym procesie. Mechanizm ten jest dość analogiczny jak w przypadku selekcji β. Jednym z krytycznych celów Syk w sygnale selekcji γδ jest sygnałosom Lat, ponieważ myszy z niedoborem Lat wykazują całkowite zahamowanie selekcji γδ i całkowity brak dojrzałych komórek γδT .

Komórki prekursorowe γδ pochodzące od myszy z niedoborem Syk/Zap70 lub myszy z niedoborem Lat są nieodróżnialne od komórek linii αβT pod względem ekspresji ich białek powierzchniowych, z wyjątkiem γδTCR, i nadal zachowują potencjał do różnicowania się w komórki αβT. Co decyduje o losie różnicowania do linii αβT lub γδT z prekursora? Pytanie to zostało podjęte w badaniach z wykorzystaniem transgenicznych myszy γδTCR. Gdy sygnał γδTCR został osłabiony przez niedobór albo białek sygnalizacyjnych, albo endogennych ligandów dla transgenicznego γδTCR, komórki prekursorowe dały początek komórkom linii αβT DP kosztem komórek linii γδT . Wyniki te sugerują, że silniejszy sygnał (prawdopodobnie po interakcji γδTCR z ligandem) prowadzi do zaangażowania w komórki γδT, podczas gdy słabszy sygnał (prawdopodobnie przez niezależny od ligandu pre-TCR) prowadzi do różnicowania αβT. Jednak eksperymenty z użyciem innego transgenicznego szczepu myszy wyrażającego γδTCR o tej samej ligandospecyficzności wykazały, że komórki γδT były w stanie dojrzewać przy braku ligandów. Chien i współpracownicy zastosowali metodę barwienia tetramerycznego w celu identyfikacji populacji komórek γδT specyficznych dla ligandu, aby zbadać znaczenie endogennych ligandów γδTCR u myszy nietransgenicznych. Wyniki wyraźnie pokazały, że liczba specyficznych dla ligandów komórek γδT była porównywalna pomiędzy myszami z niedoborem i niedoborem ligandów, co sugeruje, że większość komórek γδT nie napotkała ligandów podczas różnicowania grasicy. Autorzy dostarczyli również dowodów, że niektóre γδTCRs mogą sygnalizować ligand-niezależnie. Obserwacje te w oczywisty sposób zaprzeczają wcześniejszemu modelowi, że zaangażowanie w linię γδT wymaga interakcji ligandu γδTCR. Biorąc pod uwagę, że poliklonalne komórki γδT reagujące na pewne egzogenne ligandy różnicują się i funkcjonalnie dojrzewają w grasicy, jest prawdopodobne, że obserwacje w niektórych liniach myszy transgenicznych γδTCR nie odzwierciedlają większości komórek γδT z poliklonalnymi γδTCR.

Aby zbadać wpływ sygnału selekcji γδ na różnicowanie αβT/γδT, wykorzystaliśmy myszy z niedoborem Lat, w których różnicowanie komórek γδT jest zatrzymane na etapie prekursora CD5-. Komórki prekursorowe γδTCR+ zostały oczyszczone z dorosłych myszy z niedoborem Lat, zainfekowane retrowirusami wyrażającymi Lat i hodowane na monowarstwach komórek stromalnych (ryc. 2a). Eksperyment ten pozwala na bezpośrednią ocenę fenotypu komórek przed i po selekcji γδ w warunkach wolnych od ligandów. W porównaniu z komórkami kontrolnymi nie poddanymi transdukcji, komórki γδT wykazały wyraźną indukcję powierzchniowej ekspresji CD5 (ryc. 2b), jak również ekspresję mRNA genów sygnaturowych komórek γδT (Tcrd, Egr3, Runx3 i Bcl-2) oraz całkowite zniesienie transkrypcji genów związanych z prekursorowymi komórkami DN i komórkami αβT (Rag1, Rag2 i Ptcra) (ryc. 2c). Wyniki te wskazują, że sygnał γδTCR zarówno napędza różnicowanie w kierunku linii γδT, jak i represjonuje różnicowanie do linii αβT w sposób niezależny od ligandów.

Podsumowując, chociaż mechanizmy, dzięki którym pre-TCR i γδTCR kierują procesami różnicowania odpowiednio do linii αβT i γδT, są nadal nieuchwytne (i dyskutowane), prawdopodobne jest, że selekcja γδ, przynajmniej w większości naturalnie wygenerowanych komórek γδT, nie jest zależna od ligandu γδTCR w grasicy.

Siła sygnału γδTCR determinuje różnicowanie γδT17/γδT1

Podczas rozwoju zarówno linii αβT jak i γδT, ekspresja Syk i Zap70 jest odwrotnie regulowana: Syk ulega wysokiej ekspresji we wczesnych etapach (DN1-3 i prekursor γδ), a następnie ulega downregulacji, natomiast Zap70 ulega ekspresji w późniejszych etapach (po selekcji β lub selekcji γδ) . Komórki γδT, które przeszły przez selekcję γδ, wykazują ekspresję wysokiego poziomu Zap70, jak również kompleksów γδTCR/CD3 i mogą odpowiadać na endogenne ligandy, jeśli są one dostarczane w grasicy. Obecnie uważa się, że w przeciwieństwie do komórek αβT, komórki γδT nie ulegają napędzanej przez ligand selekcji pozytywnej lub delecji klonalnej w grasicy. Kilka badań sugeruje, że interakcja ligandu γδTCR w grasicy zamiast tego kontroluje funkcję efektorową komórek γδT.

Używając tetramerycznego barwienia populacji komórek γδT, która jest reaktywna na nieklasyczne cząsteczki MHC klasy I T10 i T22, grupa Chiena odkryła, że komórki γδT wolne od antygenu, które rozwinęły się w nieobecności ligandów, preferencyjnie produkowały IL-17, podczas gdy komórki γδT doświadczone antygenem, które rozwinęły się w obecności ligandów, głównie produkowały IFNγ . Badanie to po raz pierwszy zasugerowało ideę, że silny sygnał γδTCR indukowany przez ligand i słaby sygnał γδTCR indukują odpowiednio komórki γδT1 i γδT17. Ostatnie badanie z nowo wygenerowanymi myszami z niedoborem T10/T22 wykazało zasadniczo takie same wyniki, wspierając ten „model siły sygnału”. Model ten jest dalej wspierany przez inne badania. Dojrzewanie grasicy i różnicowanie efektorowe komórek Vγ5Vδ1 γδT wymaga Skint1 (i prawdopodobnie innych białek rodziny Skint), przypuszczalnego białka kostymulującego dla Vγ5Vδ1 TCR. W przypadku braku Skint1, komórki γδT Vγ5Vδ1 są błędnie kierowane do fenotypu komórek γδΤ17 kosztem fenotypu komórek γδΤ1. Ponadto, rozwój komórek γδT1 wymaga również kostymulacji przez CD27, białko z nadrodziny receptorów TNF, które ulega ekspresji w komórkach γδT1, ale nie w komórkach γδT17. Ostatnio grupa Penningtona zidentyfikowała grasicze bipotencjalne komórki γδT (CD24lo CD44lo CD45RBlo), które mogą dać początek zarówno komórkom γδT17, jak i komórkom γδT1. W hodowli organów grasicy płodowej rozwój komórek γδT17 był hamowany przez silne sygnały TCR indukowane przez stymulację przeciwciałami anty-TCRδ lub anty-CD3ε, ale efekty te zostały zniesione przez farmakologiczne hamowanie ścieżki MEK/ERK . Dane te dostarczają bezpośrednich dowodów na poparcie idei, że siła sygnału γδTCR jest krytycznym wyznacznikiem funkcji efektorowej komórek γδT.

Na poziomie transkrypcyjnym silny sygnał γδTCR indukuje ekspresję regulatorów transkrypcji związanych z γδT1, takich jak Egr2, Egr3 i Id3, co skutkuje losem komórek γδT1 . Id3 hamuje przyjęcie losu komórkowego γδT17 poprzez hamowanie regulacji transkrypcyjnej pośredniczonej przez HEB (kodowany przez Tcf12). HEB może bezpośrednio wiązać się z miejscami startu transkrypcji Sox4 i Sox13 w celu promowania ich ekspresji. Te związane z γδT17 czynniki transkrypcyjne są wymagane do ekspresji istotnego czynnika transkrypcyjnego RORγt (kodowanego przez Rorc) i białka sygnalizacyjnego Blk. Biorąc pod uwagę te fakty, model siły sygnału TCR wyraźnie pokazuje mechanizmy, za pomocą których sygnał TCR kontroluje funkcję efektorową komórek γδT.

Jednakże seria badań wykazała wpływ genetycznej ablacji cząsteczek sygnalizacyjnych TCR na funkcję efektorową komórek γδT, podważając ideę, że sama siła sygnału γδTCR określa los różnicowania γδT17/γδT1. Myszy zmutowane Zap70 W163C wykazują całkowitą utratę rozwoju komórek Vγ6+ γδT17, ale mają normalny rozwój komórek γδT1, podczas gdy sygnały TCR są tłumione u tych myszy. Inne badanie przeprowadzone przez Silva-Santos i współpracowników wykazało, że myszy haploinsufficient dla CD3δ i CD3γ (CD3DH), które miały niższą ekspresję na powierzchni komórek kompleksów γδTCR/CD3 i upośledzoną sygnalizację γδTCR, wykazały znaczną redukcję rozwoju grasiczego komórek Vγ6+ γδT17, jak również komórek γδT1, ale nie komórek Vγ4+ γδT17, wskazując, że podsety γδT17 wymagają różnej siły sygnału γδTCR do ich rozwoju. Chociaż rozwój komórek αβT i transdukcja sygnału αβTCR nie były zaburzone u myszy CD3DH, ten szczep myszy jest jedynym jak dotąd modelem zwierzęcym, w którym wykazano specyficzne zahamowanie sygnalizacji γδTCR. Nadal nie jest jasne, dlaczego komórki γδT są specyficznie zaburzone u myszy CD3DH, ale jest prawdopodobne, że odmienny skład kompleksów TCR-CD3 w komórkach αβT i γδT odpowiada za unikalny fenotyp myszy CD3DH. W tym kontekście należy zauważyć, że myszy z mutacją CD3ε C80G, która nie jest w stanie indukować zmian konformacyjnych w TCR, również wykazują upośledzony rozwój komórek γδT17, ale prawidłowy rozwój komórek γδT1 .

Syk jest wymagany do różnicowania γδT17

Ostatnio donieśliśmy o nowym mechanizmie regulacyjnym, w którym proksymalne kinazy γδTCR Syk i Zap70 różnie kontrolują indukcję γδT17 . Myszy z niedoborem Syk wykazują całkowitą utratę komórek γδT17 (zarówno podzbiorów Vγ4+ jak i Vγ6+) w grasicy. Warto zauważyć, że wymuszona ekspresja Zap70 w komórkach T-progenitorowych pozbawionych Syk nie przywróciła generacji komórek γδT17, co sugeruje nieredundantną rolę Syk w różnicowaniu γδT17. Ponieważ komórki γδT pozbawione Syk, ale nie Zap70, wykazują znaczącą redukcję fosforylacji Akt indukowanej przez stymulację γδTCR, wskazuje się, że Syk pośredniczy w indukowanej przez γδTCR aktywacji szlaku PI3K-Akt. Myszy z niedoborem PI3K (p110γ-/- p110δ-/-) wykazują całkowite zahamowanie rozwoju komórek γδT17, ale nie mają wpływu na selekcję γδ (wzrost CD5) lub rozwój γδT1. Wykazano, że inhibicja PI3K zmniejsza ekspresję czynników transkrypcyjnych związanych z γδT17 (Rorc, Sox13 i Sox4), co sugeruje kluczową rolę szlaku PI3K-Akt w indukowaniu programu różnicowania γδT17. Zgodnie z tym, we wcześniejszym doniesieniu wykazano, że myszy z nieaktywną kinazą PI3Kδ lub z niedoborem PI3Kγ wykazują znaczną redukcję liczby obwodowych komórek γδT17 i poprawę stanu zapalnego zależnego od γδT17. Ścieżka PI3K-Akt jest również wymagana do różnicowania komórek αβT (Th17) produkujących IL-17, co sugeruje, że ta ścieżka sygnalizacyjna jest wspólnym mechanizmem regulacyjnym dzielonym przez linie αβT i γδT w celu indukowania podzbiorów prozapalnych produkujących IL-17.

γδTCR indukowana aktywacja szlaku PI3K-Akt zależy od Syk, ale nie od Lat, co wskazuje, że Syk napędza szlak PI3K-Akt do indukowania różnicowania γδT17 oprócz zależnego od Lat głównego szlaku sygnalizacyjnego, który indukuje selekcję γδ . Nie jest jasne, czy Syk aktywuje ścieżkę PI3K/Akt w komórkach γδT poprzez bezpośrednią interakcję, czy w sposób pośredni. Poprzednie badania wykazały, że myszy pozbawione Rasgrp1 wykazują fenotyp efektorowy komórek γδT podobny do fenotypu myszy pozbawionych PI3K (tj. utrata komórek γδT17 i wzrost liczby komórek γδT1). Ponieważ Rasgrp1 może funkcjonować jako aktywator upstream ścieżki PI3K/Akt w sygnalizacji αβTCR , jest prawdopodobne, że Rasgrp1 przekazuje sygnały z γδTCR do PI3K, aby indukować różnicowanie γδT17.

Preferencyjna utrata komórek γδT17 została również zgłoszona u myszy z niedoborem Blk, kinazy z rodziny Src wyrażonej w komórkach γδT, jak również komórkach B, chociaż jej funkcja w transdukcji sygnału γδTCR jest nieznana .

Zap70 kontroluje niektóre podsety komórek γδT

Wykazaliśmy również rolę Zap70 w różnicowaniu grasiczym komórek γδT . Myszy z niedoborem Zap70 wykazują wyraźną redukcję komórek Vγ6+, z których większość to γδT17, ale nie są dotknięte rozwojem innych komórek γδT, w tym podzbiorów Vγ1+, jak również Vγ4+. Istotnie, poziom ekspresji białka Zap70 był najwyższy w podzbiorze Vγ6+ wśród komórek γδT. Ponieważ ekspresja CD5 była niższa w komórkach Vγ6+ z niedoborem Zap70 niż w komórkach kontrolnych, Zap70 jest prawdopodobnie wymagany do dojrzewania grasiczego komórek Vγ6+. W naszych eksperymentach myszy z niedoborem Zap70 miały normalne grasicze różnicowanie komórek Vγ4+, w tym podzbioru γδT17, co jest sprzeczne z poprzednim raportem, w którym hipomorficzna mutacja Zap70 spowodowała redukcję grasiczych komórek Vγ4+ γδT17 . Ta rozbieżność może wynikać z różnych myszy użytych w tych dwóch badaniach (grupa Hayday’a użyła hipomorficznych myszy z mutacją Zap70 na tle BALB/c, podczas gdy my użyliśmy kompletnych myszy z niedoborem Zap70 na tle C57BL/6). Ponadto myszy z niedoborem Zap70 wykazały znaczącą redukcję obwodowych komórek Vγ4+, które obejmowały zarówno podsety γδT17, jak i γδT1, ale miały nieupośledzone komórki Vγ1+. Tak więc, w przeciwieństwie do jego zasadniczej roli w rozwoju komórek αβT, wymaganie Zap70 jest ograniczone do dojrzewania grasicy komórek Vγ6+ i obwodowego utrzymania komórek Vγ4+.

Nasze odkrycia dotyczące różnych ról Zap70 i Syk mogą dostarczyć nowej wskazówki do zrozumienia mechanizmów sygnalizacji γδTCR i rozwoju komórek γδT. Zap70 jest wymagany do sygnalizacji αβTCR i sygnalizacji γδTCR w niektórych podzbiorach komórek γδT. W komórkach αβT aktywacja Zap70 jest zależna od Lck, który jest sprzężony z receptorami CD4 lub CD8, które wiążą się z pMHC na powierzchni komórek prezentujących antygen. Sugeruje się zatem, że Lck-Zap70 jest osią sygnalizacyjną wyspecjalizowaną w rozpoznawaniu antygenów na drodze kontaktu komórka-komórka, chociaż w przypadku komórek γδT pozostaje niejasne, w jaki sposób Zap70 jest aktywowany pomimo braku ekspresji CD4 i CD8. W przeciwieństwie do tego, Syk jest związany z szeroką gamą immunoreceptorów, w tym pre-TCR, γδTCR, BCR i FcR . Ponieważ Syk jest zdolny do fosforylacji ITAMs i dalszych celów niezależnie od kinaz z rodziny Src, takich jak Lck, receptory te mogą być aktywowane niezależnie od ligandów lub po związaniu z różnymi rozpuszczalnymi, jak również powierzchniowymi antygenami komórkowymi. Tak więc, wykorzystanie Syk lub Zap70 w sygnalizacji immunoreceptorowej może dyktować sposób, w jaki receptor rozpoznaje antygen. Rzeczywiście, ekspresja Syk w miejsce Zap70 sprawiła, że komórki αβT były zdolne do odpowiedzi na stymulację rozpuszczalnymi przeciwciałami anty-CD3, podczas gdy normalne komórki αβT reagowały tylko na multimeryzowane przeciwciała anty-CD3, które naśladują interakcję z pMHC powierzchni komórki. Wyniki te skłoniły nas do wysunięcia hipotezy, że sposób rozpoznawania antygenów przez limfocyty może być determinowany nie tylko przez ich receptor per se, ale także przez odmienne wykorzystanie kinaz z rodziny Syk. Na podstawie tej koncepcji przewidujemy, że istnieją endogenne ligandy γδTCR wymagane do dojrzewania grasiczych komórek Vγ6+, jak również do obwodowego utrzymania komórek Vγ4+, oraz że komórki Vγ1+ nie wymagają powierzchniowych ligandów γδTCR do ich rozwoju i/lub utrzymania.

γδTCR-independent and -dependent processes for γδT17 induction

Ostatni raport elegancko wykazał, że komórki γδT17 powstają z progenitora, który jest odrębny od innych subsetów komórek γδT . Stwierdzono, że pochodzące z płodu, wewnątrzmaciczne progenitory wykazujące wysoki poziom Sox13 zostały zidentyfikowane w populacji uprzednio sklasyfikowanej jako tymocyty DN1d (CD44+CD25-c-kit-CD24hi). Te progenitory Sox13+ preferencyjnie dały początek komórkom γδT17 w zrekonstruowanej grasicy płodowej, podczas gdy inne progenitory w populacji DN2 nie dały. Co najważniejsze, progenitory Sox13+ były wykrywalne, a ich programy linii γδT17 były nienaruszone u myszy z niedoborem TCRδ lub Rag, wskazując, że los linii γδT17 jest „wstępnie zaprogramowany” przez wewnętrzny mechanizm komórkowy, niezależny od γδTCR. Wcześniejszy raport wykazał jednak, że komórki γδT17 mogą rozwijać się od stadium DN2 (CD44+CD25+c-kithi), gdy są hodowane na monowarstwie komórek stromalnych wykazujących ekspresję ligandu Notch. Może zatem istnieć potrzeba ponownego zdefiniowania etapów różnicowania i relacji progenitor-descendant w rozwoju komórek γδT.

Rysunek 3 podsumowuje procesy różnicowania komórek γδT, jak również komórek αβT, podkreślając różnice w wymaganiu sygnałów αβ/γδTCR i kinaz z rodziny Syk. Wczesne etapy różnicowania, tj. selekcja β do linii komórkowej αβT i selekcja γδ do linii komórkowej γδT, są napędzane przez niezależną od ligandu sygnalizację pre-TCR lub γδTCR, która służy jako punkt kontrolny dla komórek wyrażających funkcjonalny łańcuch TCRβ lub łańcuch γδTCR, odpowiednio. Te niezależne od ligandu sygnały receptorowe są inicjowane przez Syk, który ulega ekspresji w tymocytach DN, w tym w prekursorach γδT. W linii komórkowej γδT sygnał γδTCR przekazywany przez Syk jest również wymagany do rozpoczęcia różnicowania komórek γδT17 poprzez aktywację szlaku PI3K. Zarówno podczas selekcji β jak i γδ ekspresja Syk i Zap70 jest odwrotnie regulowana: Syk ulega downregulacji, podczas gdy Zap70 ulega upregulacji po sygnalizacji pre-TCR lub γδTCR. Dlatego też późniejszy etap różnicowania linii αβT zależy od sygnalizacji αβTCR pośredniczonej przez Zap70, która umożliwia tymocytom DP rozpoznanie pMHC na powierzchni TECs w celu pozytywnej lub negatywnej selekcji w zależności od siły interakcji αβTCR-pMHC. Z kolei sygnalizacja γδTCR przez Zap70 w odpowiedzi na endogenne ligandy determinuje funkcję efektorową komórek γδT: silny sygnał indukuje γδT1, podczas gdy słaby/brak sygnału indukuje γδT17.

.