W ludziach, około 5 do 8 litrów powietrza przechodzi w i z płuc na minutę w stanie spoczynku. Powietrze może różnić się stężeniem tlenu i CO2, może zawierać alergeny i w różnym stopniu mechanicznie rozciągać drogi oddechowe i powierzchnie wymiany gazowej. Sygnały te są odbierane, przekazywane i przetwarzane na fizjologiczne sygnały wyjściowe, takie jak kontrola ciśnienia krwi w płucach, odpowiedzi immunologiczne i rytm oddychania, ale ich mechanizm nie jest jasny. Płucne komórki neuroendokrynne (PNEC) występują u wielu organizmów, od ryb po ssaki (1). W płucach ssaków, PNEC są jedynymi unerwionymi komórkami nabłonka dróg oddechowych i stanowią mniej niż 1% całej populacji komórek nabłonka płuc (2). Chociaż dowody in vitro wskazują na udział PNEC w wyczuwaniu tlenu, tonusie mięśni gładkich oskrzeli i naczyń oraz odpowiedzi immunologicznej (1, 3), rola ta nie została wykazana in vivo. Ostatnie badania wykazały, że genetyczna ablacja PNEC u dorosłych nie wpływa na homeostazę i naprawę dróg oddechowych, co pozostawia wątpliwości co do znaczenia tych komórek in vivo (4). Patologie PNEC, w szczególności wzrost liczby PNEC, zostały udokumentowane w wielu chorobach płuc, w tym w astmie, dysplazji oskrzelowo-płucnej, mukowiscydozie, przewlekłej obturacyjnej chorobie płuc, wrodzonej przepuklinie przeponowej, hiperplazji neuroendokrynnej okresu niemowlęcego, zespole nagłej śmierci niemowląt i nadciśnieniu płucnym (5-8). W każdym przypadku pozostaje niejasne, czy wzrost PNEC jest przyczyną czy konsekwencją objawów.

W płucach myszy większość PNEC występuje w skupiskach od ~3 do 20 komórek zwanych ciałami neuroepitelialnymi (NEBs) (3, 9). Zarówno samotne, jak i skupione PNEC zawierają gęste pęcherzyki rdzeniowe, wypełnione bioaktywnymi neuropeptydami, takimi jak peptyd związany z genem kalcytoniny (CGRP) lub aminami, takimi jak serotonina (1). Są one uwalniane w odpowiedzi na bodźce, takie jak zmiany w poziomie tlenu. Neuropeptydy i aminy są zaangażowane w niektóre z tych samych procesów co PNEC (10-12), co nasuwa przypuszczenie, że mogą one pośredniczyć w funkcji PNEC. Jednak związek przyczynowy nie został wykazany in vivo.

Zaczęliśmy obecne badanie, aby odkryć mechanizmy leżące u podstaw wrodzonej przepukliny przeponowej (CDH), wady wrodzonej związanej ze znaczną dysfunkcją płuc, w tym zwiększoną odpowiedzią immunologiczną i nadciśnieniem płucnym (13). W genetycznym mysim modelu CDH odkryliśmy defekt polegający na nieudanym gromadzeniu się PNEC. Po tym następuje sekwencja zdarzeń: wzrost neuropeptydów w PNEC, wzrost nacieków immunologicznych i przebudowa struktury płuc. Odkrycia te stanowią demonstrację in vivo funkcji PNEC. Ponieważ zmiany w liczbie PNEC i związanych z nimi neuropeptydów zostały udokumentowane w wielu chorobach płuc, nasze wyniki mają szerokie implikacje poza CDH.

U ludzi, mutacje w genach receptora ronda (ROBO) zostały powiązane z CDH (13, 14). Aby zbadać wady płuc związane z CDH, inaktywowaliśmy zarówno Robo1, jak i Robo2 w nabłonku pochodzącym z endodermy, w tym w płucach, używając Shhcre (dalej Shhcre;Robo mutant) u myszy (15, 16). Chociaż te mutanty przeżywają, wykazują zmniejszoną powierzchnię wymiany gazowej, począwszy od dnia postnatalnego (P) 15 (ryc. 1, A i B, i fig. S1). Wykonaliśmy mikromacierze, a następnie ilościową reakcję łańcuchową odwrotnej transkryptazy polimerazy (qRT-PCR) w P7, przed redukcją powierzchni wymiany gazowej. Piętnaście z 20 najlepiej wyrażonych genów ma związek z odpowiedzią immunologiczną i wszystkie są znacząco zwiększone, w tym Ccl3, Cxcl2, Tnfa i Saa3 (Fig. 1C). Zgodnie z tym podpisem, zaobserwowaliśmy podwyższoną liczbę komórek odpornościowych, w tym neutrofili, eozynofili, makrofagów i komórek T (Fig. 1, D i E oraz Fig. S2). Ponadto, nastąpił wzrost proporcji makrofagów M2 i spadek proporcji makrofagów M1 (fig. S3). Odkrycia te wskazują, że mutanty Shhcre;Robo wykazują zwiększoną wrażliwość immunologiczną, naśladując częstą chorobę towarzyszącą CDH (13).

Chociaż Robo ulega ekspresji w regionie pęcherzyków płucnych mezenchymy płucnej (fig. S4), jego ekspresja w nabłonku jest ograniczona do rzadkich komórek wzdłuż dróg oddechowych (Fig. 1F). Barwienie przeciwciałem CGRP ujawniło, że komórki nabłonkowe wykazujące ekspresję Robo są PNECs (Fig. 1G). Aby potwierdzić, że geny Robo są wymagane do funkcjonowania w obrębie PNEC, inaktywowaliśmy Robo przy użyciu Ascl1creERT2 (17), sterownika knock-in cre, który nadaje aktywność specyficzną dla PNEC w nabłonku płuc (fig. S5). Stwierdziliśmy, że mutanty Ascl1creERT2;Robo wykazywały zarówno uproszczenie pęcherzyków płucnych, jak i wzrost makrofagów, rekapitulując fenotypy Shhcre;Robo (fig. S6). Te odkrycia razem pokazują, że Robo jest wymagany specyficznie w PNECs do ograniczenia liczby komórek odpornościowych i zapobiegania uproszczeniu pęcherzyków płucnych.

W dniu embrionalnym (E) 13,5, nowo określone PNECs były pojedynczymi komórkami zarówno w płucach kontrolnych, jak i zmutowanych Shhcre;Robo (ryc. 2, A i B). Do E15,5 większość PNEC połączyła się w NEBs w kontroli. Jednakże PNEC nie były skupione w mutantach Shhcre;Robo (ryc. 2, C i D). Ten wysoce penetrujący fenotyp utrzymywał się w płucach postnatalnych (Fig. 2, E i F oraz Fig. S7). Całkowita liczba komórek PNEC wydaje się być niezmieniona, co potwierdza normalna ekspresja Ascl1 i innych markerów PNEC (fig. S8). Komórki niezgrupowane w mutancie tracą swój klinowaty kształt i są bardziej zaokrąglone (fig. S7 i S9). Ponadto, w przeciwieństwie do kontroli, gdzie samotne PNEC nie są unerwione (9), ~ 33,3% (31 z 93 komórek) niezgrupowanych PNEC jest unerwionych w mutancie (Fig. 2F i fig. S9), co sugeruje, że unerwienie PNEC nie zależy od tworzenia klastrów lub od funkcji Robo w PNECs.

Mutanty Ascl1creERT2;Robo również wykazują niezgrupowanie PNEC (fig. S10). Ten fenotyp przejawiał się nawet wtedy, gdy inaktywacja Robo była indukowana postnatalnie, co jest następstwem tworzenia się NEB. Łącznie nasze wyniki ustalają, że Robo jest wymagany do złożenia PNEC i utrzymania w NEBs.

Robo może funkcjonować albo zależnie, albo niezależnie od swojego liganda, Slit (18). Analiza mutantów Slit wykazała, że podczas gdy grupowanie PNEC nie jest zaburzone w żadnym z pojedynczych mutantów, jest ono zmniejszone w mutantach Slit1;3 (fig. S11, A do D). Wynik ten sugeruje, że funkcja Robo w tym procesie jest prawdopodobnie zależna od ligandu.

Slit i Robo funkcjonują głównie w celu pośredniczenia w odpychaniu komórek i rzadko w przyciąganiu (19). Aby ustalić, czy Slit działa jako odpychający lub przyciągający sygnał dla PNECs wykazujących ekspresję Robo, najpierw określiliśmy, gdzie geny Slit ulegają ekspresji. Połączony reporter Slit1;2-GFP (zielone białko fluorescencyjne) wykazał ekspresję tylko w około 1 do 3 PNEC w obrębie dużych NEBs, podnosząc możliwość, że komórki wykazujące ekspresję Slit1/2 mogą być komórkami nukleacyjnymi klastra (fig. S11E). To również wskazuje na subspecjalizację PNEC w obrębie klastra. Ekspresja Slit3 jest ograniczona do warstwy komórek gładko-mięśniowych otaczających tętnice, która przebiega wzdłuż głównych oskrzeli, gdzie znajduje się większość NEB (fig. S11, F i G). Razem, bliskość komórek wykazujących ekspresję Slit do PNECs wykazujących ekspresję Robo podniosła możliwość, że ligandy Slit mogą stanowić atrakcyjną wskazówkę dla PNECs.

Aby to sprawdzić, posortowane za pomocą cytometrii przepływowej GAD1-GFP+ PNECs zostały zasiane w górnej komorze wkładki do hodowli migracji komórek Boydena. Kiedy dodano białko Slit do komórek w górnej komorze, ~ 52% mniej (P = 8,5 × 10-4) PNEC migrowało do dolnej komory (fig. S12, J do I). I odwrotnie, gdy białko Slit dodano do komory dolnej, 18% więcej (P = 7,5 × 10-5) PNEC migrowało na dno (ryc. S11, L do N). Wyniki te sugerują, że Slit-Robo napędzają grupowanie PNEC w NEBs, prawdopodobnie poprzez przyciąganie komórkowe.

Aby sprawdzić możliwy związek między PNECs a odpowiedzią immunologiczną, zbadaliśmy ekspresję neuropeptydów produkowanych przez PNECs (1). Spośród dziewięciu badanych genów neuropeptydów, pięć było znacząco wyregulowanych u mutantów Shhcre;Robo (Ryc. 3A). Barwienie przeciwciałem przeciwko CGRP ujawniło, że chociaż jego ekspresja pozostaje w PNECs w mutancie, intensywność barwienia jest zwiększona i nie jest już ograniczona do strony podstawnej tych komórek (fig. S7 i S9). Zauważamy również, że podczas gdy unclustering nastąpił do E15,5, wzrost regulacji neuropeptydów jest obserwowany tylko po urodzeniu, przypuszczalnie po ekspozycji na powietrze (fig. S12).

Aby ustalić, czy wzrost neuropeptydów przyczynia się do odpowiedzi immunologicznej, skupiliśmy się na CGRP, ponieważ jego transkrypt wykazuje największy wzrost wśród wszystkich badanych (Fig. 3A). Przeciwstawiliśmy się temu wzrostowi hodując zmutowany allel Cgrp w tle Shhcre;Robo (20). W kontrolach Robo utrata Cgrp nie zmieniła liczby makrofagów (Fig. 3, B, D i F). Jednakże u mutantów Shhcre;Robo utrata Cgrp znacząco zmniejszyła liczbę makrofagów w sposób zależny od dawki (ryc. 3, C, E i F). Stwierdziliśmy również, że utrata Cgrp częściowo odwróciła fenotyp uproszczenia pęcherzyków płucnych (fig. S13). Zwracamy uwagę, że ani wzrost makrofagów, ani uproszczenie pęcherzyków płucnych nie zostały całkowicie uniemożliwione, co sugeruje, że wzrost innych neuropeptydów może przyczynić się do efektów końcowych. Łącznie wyniki te dostarczają genetycznej demonstracji in vivo, że neuropeptydy pośredniczą w funkcji PNEC.

Jako że normalna pęcherzykowatość rozpoczyna się w P4 (21), późne pojawienie się uproszczenia pęcherzyków płucnych w P15 sugeruje, że zaburzenie pęcherzykowatości może nie być główną przyczyną. Chociaż do P10 nie zaobserwowano zmian w śmierci komórek, nastąpiła wyraźna redukcja elastyny (fig. S14), która jest możliwym czynnikiem wyzwalającym upraszczanie (22). Komórki odpornościowe, takie jak makrofagi, wyrażają metaloproteinazy macierzy, które degradują elastynę (23). Ponadto, wzrost makrofagów jest obserwowany przed uproszczeniem (fig. S1 i S2), podnosząc możliwość związku przyczynowego. Aby to sprawdzić, potraktowaliśmy płuca Shhcre;Robo i kontrolne płuca klodronianem, hydrofilnym lekiem, który pozbawia makrofagi (24). Leczenie rozpoczynające się w P5, przed wzrostem komórek odpornościowych, skutecznie ograniczyło liczbę makrofagów pęcherzykowych do poziomu podstawowego u mutantów Shhcre;Robo (ryc. 4, A do E). To złagodziło spadek elastyny i całkowicie zapobiegło uproszczeniu (ryc. 4, F do J, i fig. S15). Razem te dane oferują in vivo demonstrację, że zwiększone nacieki immunologiczne są odpowiedzialne za uproszczenie pęcherzyków płucnych i że oba są następstwami dysfunkcji PNEC.

W tym badaniu przedstawiamy genetyczne dowody in vivo wykazujące, że PNEC, pomimo ich rzadkości, mają głęboki wpływ na postnatalną funkcję płuc. Chociaż defekt PNEC jest już widoczny w E15.5 u mutanta Shhcre;Robo, fizjologiczne rezultaty, począwszy od regulacji neuropeptydów, rozpoczynają się po urodzeniu. Sugeruje to, że efekt PNEC jest zależny od ekspozycji płuc na powietrze. Tak więc, nasze odkrycia wytyczają tryb transdukcji sygnału, w którym PNEC są wrażliwymi reostatami na ścianie dróg oddechowych, które tłumaczą wskazówki środowiskowe nie-autonomicznie na odpowiedzi immunologiczne.

Nasze wyniki ustanawiają Robo1,2 jako zestaw genów, które kontrolują grupowanie PNEC w NEBs. Przedstawia również Slit i Robo jako graczy w selektywnym sortowaniu komórek w nabłonku narządu ssaków. Inaktywacja Robo po utworzeniu NEB również prowadziła do odłączenia się od skupisk, co sugeruje, że skupiska są aktywnie utrzymywane. Chociaż Slit-Robo są w dużej mierze znane z pośredniczenia w odpychaniu komórek, nasze dane wskazują, że napędzają one grupowanie PNEC poprzez przyciąganie komórek. Inaktywacja Robo doprowadziła do zmiany unerwienia i utraty podstawowej lokalizacji neuropeptydów. Zmiany te mogą leżeć u podstaw zmienionego wpływu downstream PNECs.

Zwiększenie liczby PNEC zostało udokumentowane w szerokim wachlarzu chorób związanych z płucami, od rzadkich zaburzeń, takich jak CDH, do powszechnych warunków, takich jak astma (5-8). Zwracamy uwagę, że fenotyp PNEC mutanta Robo jest odmienny od zwiększonej liczby PNEC. Jednak oba są związane ze zwiększoną ilością neuropeptydów, które, jak wykazaliśmy, są silnymi efektorami funkcji PNEC. Nasze ustalenia przewidują zatem, że zamiast być pasywnym odczytem choroby, udokumentowane patologie PNEC i wzrost neuropeptydów mogą służyć jako aktywne czynniki przyczyniające się do objawów w szerokim wachlarzu chorób układu oddechowego.

.