ABSTRACT

Przed ligacją, każdy fragment Okazaki syntetyzowany na nici opóźniającej u eukariotów musi być przetworzony nukleolitycznie. Rozszczepienie nukleazy odbywa się w kontekście struktur klapek 5′ generowanych poprzez syntezę z przemieszczeniem nici przez polimerazę DNA delta. Co najmniej trzy nukleazy DNA: Rad27 (Fen1), Dna2 i Exo1, zostały zaangażowane w przetwarzanie fragmentów Okazaki. Jednakże ani udział poszczególnych nukleaz w syntezie nici opóźniających, ani struktura intermediatów DNA powstających pod ich nieobecność nie zostały jasno określone in vivo. Poprzez warunkowe pozbawienie nukleaz pasm opóźniających i bezpośrednią analizę fragmentów Okazaki syntetyzowanych in vivo w S. cerevisiae, przeprowadziliśmy systematyczną ocenę wpływu Rad27, Dna2 i Exo1 na syntezę pasm opóźniających. Stwierdziliśmy, że Rad27 przetwarza większość nić laggingową, przy znaczącym dodatkowym udziale Exo1, ale nie Dna2. Gdy rozszczepienie nukleazy jest upośledzone, obserwujemy redukcję syntezy z przemieszczeniem nici, w przeciwieństwie do powszechnego generowania długich fragmentów Okazaki 5′, jak przewidują niektóre modele. Ponadto, używając konstruktów ograniczonych do cyklu komórkowego, wykazujemy, że zarówno nukleolityczne przetwarzanie, jak i ligacja fragmentów Okazaki mogą być odłączone od replikacji DNA i opóźnione do czasu, gdy synteza większości genomu zostanie zakończona.