T3T3 Neutral red uptake assay. Badanie 3T3 NRU zostało oficjalnie zatwierdzone przez OECD i zatwierdzone jako OECD TG432 w dniu 13 kwietnia 2004 r. (3). Test ten ocenia fotocytotoksyczność poprzez określenie względnego zmniejszenia żywotności komórek po ekspozycji na badany artykuł w obecności lub przy braku promieniowania UV/VIS. Decyzję o przeprowadzeniu badania fototoksyczności 3T3 NRU podejmuje się dla substancji chemicznych, które wykazują widmo absorpcji w obszarze UV/VIS po rozpuszczeniu w odpowiednim rozpuszczalniku (17). Sugeruje się, że jeśli molowy współczynnik ekstynkcji/absorpcji jest mniejszy niż 10 l x mol-1 x cm-1, jest mało prawdopodobne, aby substancja chemiczna była fotoreaktywna (np. w kuwecie UV o długości drogi światła 1 cm, OD roztworu 0,05 M powinno być mniejsze niż 0,5, aby uznać go za niefotoreaktywny w oparciu o równanie „absorbancja = współczynnik ekstynkcji x długość drogi x stężenie”) (26). Test 3T3 NRU wykazuje wysoką czułość, ale niską specyficzną zdolność predykcyjną (czułość 93% i specyficzność 84%). Test 3T3 NRU ma wiele ograniczeń. Nie jest w stanie przewidzieć innych niż foto(cyto)toksyczność działań niepożądanych, które mogą powstać w wyniku skojarzonego działania substancji chemicznej i światła, takich jak fotogenotoksyczność, fotoalergia (fotouczulenie) czy fotokarcynogenność. Badanie 3T3 NRU jest stosowane tylko do identyfikacji zagrożeń, natomiast jego przydatność do oceny siły działania fototoksycznego jest nieuzasadniona. W szczególności, ten system badawczy nie posiada aktywności metabolicznej, która jest krytyczna w manifestacji substancji chemicznych narażonych systemowo. Dlatego dla substancji chemicznych narażonych układowo, które wymagają aktywacji metabolicznej, jak monokrotalina, riddelliina i heliotryna (alkaloidy pirolizydynowe) (28), zaleca się badania in vivo na zwierzętach (5,29).

Podstawową zasadą badania 3T3 NRU jest porównanie żywotności komórek w obecności lub braku napromieniowania UV/Vis, jak oznaczono z istotnym barwnikiem, czerwienią obojętną, która jest słabym barwnikiem kationowym, który łatwo przenika przez błony komórkowe i gromadzi się wewnątrzkomórkowo w lizosomach żywych komórek. Podstawową linią komórkową są komórki Balb/c 3T3, które są fibroblastami mysimi wyhodowanymi z embrionów myszy przez G.T. Todaro w 1968 roku. Oznaczenie 3T3 oznacza „3-dniowy transfer, inokulum 3 × 105 komórek” w 20 cm2 naczynia, a komórka ta jest stosunkowo stabilna, łatwo dostępna i łatwa w obsłudze (30). Skórny fibroblast jest jedną z komórek docelowych fototoksyczności, co stanowi solidne uzasadnienie dla zastosowania komórek 3T3.

Aby zdecydować, czy badany artykuł jest fototoksyczny czy nie w teście 3T3 NRU, należy uzyskać odpowiedź stężenie-odpowiedź w obecności i przy braku napromieniowania. Należy obliczyć współczynnik fotodrażnienia (PIF) lub średni fotoefekt (MPE) (31). PIF jest stosunkiem IC50 (stężenie, które zmniejsza żywotność komórek o 50%) nie napromieniowanych do napromieniowanych, jak pokazano na Rys. 7.

Model predykcji fotocytotoksyczności za pomocą PIF (Photo-irritation factor).

Gdy nie można uzyskać IC50, MPE oblicza się według następującego równania

PIF < 2 lub MPE < 0,1 przewiduje: „brak fototoksyczności”. A PIF > 2 i < 5 lub MPE > 0,1 i < 0,15 przewiduje: „prawdopodobna fototoksyczność”, a PIF > 5 lub MPE > 0,15 przewiduje: „fototoksyczność” (ryc. 8).

Obliczanie efektu fotograficznego: Fotoefekt (PEC) przy arbitralnym stężeniu C definiuje się jako iloczyn efektu odpowiedzi (REC) i efektu dawki (DEC), tj. PEC = REC × DEC. Definicja ta jest zilustrowana w sposób zaczerpnięty z (31). Obliczenie fotoefektu przy stężeniu 0,4 następuje zgodnie z równaniami podanymi w tekście, co daje: efekt odpowiedzi RE0,4 = (66% – 11%)/100% = 0,55, efekt dawki DE0,4 = (0,4/0,16 – 1)/(0,4/0,16 + 1) = 0,43, a fotoefekt PE0,4 = 0,24. Średni fotoefekt uzyskuje się przez uśrednienie wartości fotoefektu przy różnych stężeniach (31).

Test hemolizy erytrocytów. Błony komórkowe są podatne na działanie fotochemicznie generowanych ROS i rodników. Wywołane promieniowaniem UVA uszkodzenia erytrocytów i wynikająca z nich hemoliza (fotohemoliza) jest wykorzystywana do oceny potencjału fototoksycznego badanych produktów (32). Owcze krwinki czerwone (SRBC) inkubuje się z substancjami chemicznymi i napromieniowuje promieniami UVA o mocy 20 J/cm2. Po napromieniowaniu, SRBC inkubowano w ciemności przez 2 godz. w temperaturze pokojowej, a następnie przez kolejną 1 godz. w temperaturze 37℃, po czym mierzono hemolizę za pomocą odczynnika Drabkina i pomiaru absorbancji UV przy 540 nm. Zakres fototoksyczności oceniano na podstawie uwalniania hemoglobiny z SRBC, tj. aktywności fotohemolitycznej zgodnie z równaniem (33).

• ADE: gęstość optyczna naświetlonego roztworu leku z erytrocytami

• AD: gęstość optyczna naświetlonego roztworu leku bez erytrocytów

• C: gęstość optyczna 100% hemolitycznego roztworu kontrolnego

Fotototoksykanty takie jak ciprofloksacyna, norfloksacyna czy enoksacyna znacząco zwiększają aktywność fotohemolityczną powyżej 20% przy stężeniu 100 μg/mL. Czułość, specyficzność i dokładność tego testu wynosiła 67%, 73% i 73%, odpowiednio dla 24 substancji chemicznych (8 substancji zapachowych, 5 absorberów UV, 4 leków, 4 środków przeciwdrobnoustrojowych i 3 barwników) w porównaniu z testem in vivo na świnkach morskich (34). Niska czułość może być problematyczna, a jego wydajność jest znacznie gorsza niż testu 3T3 NRU, co może wyjaśniać zmniejszone wykorzystanie tego testu w ostatnim czasie.

Model ludzkiego naskórka 3D in vitro. Aby przezwyciężyć ograniczenia metod opartych na komórkach in vitro, bada się model 3D zrekonstruowanego naskórka w celu zastosowania go w badaniach fototoksyczności (35,36). Zasadniczo zasada badania jest podobna do badania 3T3 NRU, a mianowicie ocena różnicy żywotności tkanek w obecności i przy braku napromieniowania UV/VIS. Można zastosować podobny model predykcyjny wykorzystujący PIF i MPE (37). W modelu naskórka 3D można natomiast badać materiały nierozpuszczalne w wodzie, a w pierwotnych keratynocytach warstwy naskórkowej zachowany jest pewien zakres zdolności metabolicznych, który może być zastosowany do toksykantów wymagających aktywacji metabolicznej (38). Ponadto możliwe są pomiary produkcji cytokin, takich jak IL-1β (Interleukin-1β) (39), próba kometowa (40) i badania histologiczne, które można uwzględnić w dalszej ocenie fotoalergiczności i fotokarcynogenności.

Metody in vivo z wykorzystaniem świnki morskiej, myszy lub szczurów pigmentowanych. Zwierzęta laboratoryjne takie jak myszy i świnki morskie są wykorzystywane do symulowania rzeczywistych scenariuszy fototoksyczności u ludzi. Zwierzęta są narażone na działanie chemikaliów miejscowo lub układowo i napromieniowane odpowiednią dawką UVA (zwykle 10 J/cm2 w badaniu na śwince morskiej, 20 J/cm2 w badaniu na myszach (41)). Ocena punktowa rumienia i obrzęku od 0 do 4 jest sumowana, a maksymalny wynik podczas 72-godzinnej obserwacji jest uśredniany dla każdego zwierzęcia w celu wygenerowania wskaźnika podrażnienia. Wskaźnik fototoksyczności uzyskuje się za pomocą równania „Wskaźnik podrażnienia miejsca napromieniowanego UVA – Wskaźnik podrażnienia miejsca nienapromieniowanego” (42). Wskaźnik fototoksyczności powyżej 0,6 wskazuje na możliwość wystąpienia fototoksyczności. Alternatywnie można zmierzyć grubość ucha w celu oszacowania obrzęku w badaniach na myszach. Te badania in vivo dobrze odzwierciedlają proces patofizjologiczny fototoksyczności u ludzi, ale poświęcenie zwierząt, wydatki i czas potrzebny na przeprowadzenie badania stwarzają wiele problemów, zwłaszcza w dobie powszechnej świadomości dobrostanu zwierząt i etyki. Aby przezwyciężyć te problemy, coraz większą popularność zdobywają badania fototoksyczności bez udziału zwierząt (43).

Metody in chemico oceny fototoksyczności. Do oceny fototoksyczności zbadano metody bezkomórkowe w probówkach, czyli in chemico. Informacje o absorpcji światła i fotostabilności badanego wyrobu analizowano w celu przewidywania fototoksyczności (44). Wykorzystując wytwarzanie reaktywnych form tlenu podczas fotoekscytacji i następującej po niej fotoreakcji, potencjał fototoksyczny substancji chemicznej można ocenić in chemico(12). Tlen singletowy jest wykrywany przez wybielanie p-nitrozodimetyloaniliną (RNO), podczas gdy test błękitu nitrowego z tetrazoliną (reakcja NBT-formazan) jest stosowany do określenia wytwarzania nadtlenków, jak pokazano poniżej (24),

• Tlen usingletowy + imidazol

• → → utleniony imidazol

• + RNO

• → wybielanie RNO + produkty

Test generowania ROS wykazał czułość i specyficzność 90% i 76.9% dla kosmetyków oraz 100% i 75% dla niekosmetycznych substancji chemicznych. Aktywność niszczenia nici DNA jest kolejnym sposobem oceny fototoksyczności indukowanej promieniowaniem UV różnych rodzajów substancji chemicznych lub leków in chemico poprzez ilościowe określenie otwartego lub zamkniętego kolistego DNA. Ten test również nie wymaga żywych komórek lub tkanek, ale plazmidu. Plazmid jest rozpuszczany w buforze i mieszany z badanymi substancjami. Po naświetleniu mieszaniny promieniami UV, próbki poddawane są elektroforezie. Ilość rozbitego DNA analizowana jest techniką fluorescencyjną. Indukowane promieniowaniem UV fototoksyczne związki powodują otwieranie nici DNA i jest to zależne od stężenia leku i dawki promieniowania UV (33). Testy te nie wymagają żywych komórek lub tkanek, które mogą zwiększać zmienność wyników badań. Metody te mają jednak ograniczenia, do których należy brak zdolności aktywacji metabolicznej, niemożność zastosowania w przypadku materiałów nierozpuszczalnych w wodzie (oleje, ciała stałe, żele, produkty preparowane) oraz niemożność przewidzenia fotogenotoksyczności, fotoalergii (fotouczulenia) lub fotokarcynogenności. Badanie to jest ograniczone do identyfikacji zagrożeń, a nie do oceny siły działania fototoksycznego.

.