PMC
Używanie NEBcuttera
NEBcutter przyjmuje sekwencję wejściową, która może być wklejona, pobrana z pliku lokalnego lub pobrana z NCBI jako plik GenBank poprzez jej numer akcesyjny. Dostępne są różne opcje pozwalające wybrać rozmiar ORF-ów, które mają być wyświetlane oraz zestaw enzymów restrykcyjnych, które mają być użyte. Program oblicza pozycje wszystkich miejsc dla enzymów restrykcyjnych, zwracając uwagę na te, które mogą być potencjalnie zablokowane przez nakładającą się metylację i znajduje ORF-y w sekwencji. Następnie wyświetla schemat sekwencji, długie ORF-y, oparte na zasadach opisanych w Metodach i wszystkie enzymy restrykcyjne, które przecinają je tylko raz. Początkowe wyświetlanie pokazuje również enzymy, które mogą być użyte w kompletnym trawieniu do wycięcia każdego ORF, który jest wyświetlany. Rysunek 11 przedstawia typowe trawienie, w tym przypadku liniowy widok plazmidu pBR322. Jeśli oryginalna sekwencja DNA jest kolista, to oferowane są zarówno liniowe, jak i koliste wyświetlenia. Z początkowego wyświetlania istnieje wiele opcji, aby przejść dalej, w tym niestandardowe trawienie z enzymami do wyboru i różne wyświetlanie trawienia. Możliwe jest również, w przypadku wyświetlania liniowego, powiększenie wybranego regionu sekwencji w celu uzyskania bardziej szczegółowego widoku. Jedna z opcji pozwala na wybranie konkretnego regionu i wyświetlenie tych enzymów, które tną bezpośrednio przylegający do tego regionu. Jest to przydatne w celu znalezienia enzymów zdolnych do wycięcia pożądanego regionu. Jeśli powiększanie prowadzi do regionu <60 nukleotydów, wówczas wyświetlana jest rzeczywista sekwencja (Rys. (Rys.2),2), wraz z odpowiednim tłumaczeniem. Na tym ekranie pokazane są wszystkie enzymy, które przecinają sekwencję, wszystkie zasady, które tworzą część sekwencji rozpoznawania enzymów restrykcyjnych są podświetlone, a najechanie myszą na nazwę enzymu spowoduje wyświetlenie ramki z zaznaczoną sekwencją rozpoznawania, a sama sekwencja zostanie podkreślona na ekranie.
Liniowe wyświetlanie trawienia plazmidu pBR322. Należy zauważyć, że dwa główne ORF-y są otoczone przez miejsca (MseI i PflMI; BspHI i EarI), które mogą być użyte do ich wycięcia z pełnej sekwencji plazmidu. W tej prezentacji pokazane są tylko enzymy, które jednorazowo rozszczepiają sekwencję. Opcje dalszego trawienia i wyświetlania są dostępne poprzez przyciski na dole ekranu.
Powiększony ekran krótkiego regionu z pBR322. Zauważ, że zasady zaznaczone na czerwono i niebiesko tworzą części miejsc rozpoznawania enzymów restrykcyjnych. Te czerwone są jednoznaczne, podczas gdy niebieskie to zasady zdegenerowane. Tak więc BsiEI rozpoznaje sekwencję CGRYCG. Zewnętrzne reszty CG są niezmienne, natomiast wewnętrzne zasady są zdegenerowane i w przedstawionej sekwencji są GT. Zasady zaznaczone na czarno nie stanowią części żadnego miejsca rozpoznania enzymu restrykcyjnego. Ten ekran może być przydatny do znalezienia enzymów restrykcyjnych zdolnych do rozróżniania alleli SNP.
Na każdym głównym ekranie, przesuwając mysz nad nazwę enzymu restrykcyjnego, zostanie wyświetlona jego sekwencja rozpoznawania i dokładny numer zasady, przy której rozszczepia. Jeśli dla danego enzymu występuje więcej niż jedno miejsce, wszystkie pozostałe miejsca są podkreślone. Kliknięcie na nazwę enzymu spowoduje wyświetlenie strony zawierającej podsumowanie informacji o enzymie, w tym jego wrażliwość na metylację, rodzaje wytwarzanych końców, dostępne izoschizomery i listę innych enzymów, które mogą wytwarzać kompatybilne końcówki. W przypadku enzymów NEB, podawane są informacje o warunkach trawienia i link do strony internetowej NEB.
Kluczową cechą NEBcuttera jest to, że zawiera on wszystko, co jest zarejestrowane w REBASE na temat wrażliwości metylacyjnej któregokolwiek z wyświetlanych enzymów, gdy nakładają się one na miejsce Dam (GATC), miejsce Dcm (CCWGG), miejsce CpG, miejsce EcoKI (AACN6GTGC) lub miejsce EcoBI (TGAN8TGCT). Gdy wykonuje się trawienie teoretyczne, wyniki zawierają porównanie efektów metylacji z zaznaczeniem pasm, które ulegają przesunięciu (Rys. (Rys.33).
Trawienie teoretyczne przedstawiające efekty nakładającej się metylacji Dcm na miejsca MscI (sekwencja rozpoznająca: TGGCCA) obecne w sekwencji, gdyby bakteriofag lambda był hodowany w szczepie E.coli wyrażającym metylotransferazę Dcm (sekwencja rozpoznająca: CCWGG). Fragmenty ulegające metylacji Dcm zaznaczone są na czerwono. Wirtualny żel jest oparty na interpolacji krzywej splajnu sześciennego wygenerowanej na podstawie danych eksperymentalnych uzyskanych z fragmentów o znanym rozmiarze.
Na każdej stronie znajdują się gorące linki, które prowadzą z powrotem do strony głównej, zapewniają pomoc w interpretacji wyświetlanego obrazu lub pozwalają użytkownikom na przesłanie komentarzy do autorów. Interfejs został zaprojektowany tak, aby był jak najbardziej intuicyjny i zapewniał łatwy dostęp do głównych funkcji przydatnych badaczom podejmującym próby rozszczepiania DNA. Obecna wersja programu NEBcutter przetworzyła ponad 400 000 sekwencji otrzymanych od użytkowników. Obecnie przygotowujemy szereg ulepszeń do NEBcuttera, a wersja 2.0 ma zostać wydana do 1 lipca.
.