Główny dogmat biologii molekularnej brzmi: DNA→RNA→białko. Aby zsyntetyzować określone białko, DNA musi najpierw zostać przepisane na posłańca RNA (mRNA). mRNA może następnie zostać przetłumaczone przez rybosom na łańcuchy polipeptydowe, które tworzą podstawową strukturę białek. Większość białek jest następnie modyfikowana poprzez szereg modyfikacji potranslacyjnych, w tym składanie białek, tworzenie mostków disulfidowych, glikozylację i acetylację, w celu stworzenia funkcjonalnych, stabilnych białek. Ekspresja białek odnosi się do drugiego etapu tego procesu: syntezy białek z mRNA i dodawania modyfikacji potranslacyjnych

Naucz się więcej biologii molekularnej w naszym eBooku Plazmidy 101!

Badacze wykorzystują różne techniki do kontrolowania ekspresji białek do zastosowań eksperymentalnych, biotechnologicznych i medycznych. Naukowcy mogą wizualizować białka in vivo poprzez znakowanie ich białkami fluorescencyjnymi w celu zbadania lokalizacji lub oczyszczać białka w celu zbadania ich struktury, interakcji i funkcji. Białka mogą być również oczyszczane w celu wykorzystania w badaniach biologii molekularnej (np. polimerazy i inne enzymy mogą być oczyszczane i wykorzystywane do manipulacji DNA), lub w medycynie (np. insulina).

Białka, w przeciwieństwie do DNA, które może być stosunkowo łatwo syntetyzowane, muszą być produkowane przy użyciu złożonych mieszanin pochodzących z komórek lub przy użyciu żywych komórek. Istnieje kilka rodzajów systemów ekspresji wykorzystywanych do produkcji i oczyszczania białek. Należą do nich ssaki, owady, bakterie, rośliny, drożdże i systemy ekspresji bezkomórkowej.

Ogólna strategia ekspresji białek polega na transfekcji komórek wybranym szablonem DNA i umożliwieniu tym komórkom transkrypcji, translacji i modyfikacji interesującego nas białka. Zmodyfikowane białka mogą być następnie wyekstrahowane z lizowanych komórek przy użyciu znaczników białkowych i oddzielone od zanieczyszczeń przy użyciu różnych metod oczyszczania. Decyzja, który system ekspresji zastosować, zależy od kilku czynników:

1. Białko, które próbujesz wyrazić
2. Jak dużo białka potrzebujesz
3. Twoich planów dotyczących dalszych zastosowań

W tym wpisie na blogu podsumujemy niektóre z bardziej powszechnych systemów ekspresji, w tym ich zalety i zastrzeżenia, o których należy pamiętać przed wyborem systemu.

Systemy ekspresji ssaków

Komórki ssaków są idealnym systemem do ekspresji białek ssaków, które wymagają wielu modyfikacji posttranslacyjnych dla prawidłowej funkcji białka. Większość konstruktów DNA przeznaczonych do ekspresji u ssaków wykorzystuje promotory wirusowe (SV40, CMV i RSV) w celu zapewnienia silnej ekspresji po transfekcji. Systemy ssaków mogą wyrażać białka zarówno przejściowo, jak i poprzez stabilne linie komórkowe. Obie metody dają wysoką wydajność białek, jeśli transfekcja jest udana.

Niektóre systemy ssaków pozwalają również na kontrolę nad tym, kiedy białko jest wyrażane poprzez użycie konstytutywnych i indukowalnych promotorów. Indukowalne promotory są niezwykle przydatne, jeśli pożądany produkt białkowy jest toksyczny dla komórek w wysokich stężeniach. Pomimo swoich zalet, systemy ekspresji ssaków wymagają wymagających warunków hodowli komórkowej w porównaniu z innymi systemami.

Systemy ekspresji owadów

Komórki owadów mogą być również wykorzystywane do produkcji złożonych białek eukariotycznych z odpowiednimi modyfikacjami potranslacyjnymi. Istnieją dwa rodzaje systemów ekspresji owadów; komórki owadzie zakażone bakulowirusem i komórki owadzie nielotne.

Baculowirusowe systemy ekspresji są bardzo potężne dla wysokiego poziomu ekspresji białek rekombinowanych. Systemy te umożliwiają wysoką ekspresję bardzo złożonych, glikozylowanych białek, które nie mogą być produkowane w komórkach E. coli lub drożdży. Jedyny problem z systemami bakulowirusowymi polega na tym, że zainfekowana komórka gospodarza ulega ostatecznie lizie. Liza komórki zatrzymuje produkcję białek, ale istnieją systemy ekspresji nielizy komórek owadzich (komórki sf9, Sf21, Hi-5), które pozwalają na ciągłą ekspresję genów zintegrowanych z genomem komórki owadziej. Oba te typy systemów ekspresji owadów mogą być skalowane do produkcji dużych ilości białka.

Niektóre wady systemów ekspresji komórek owadzich obejmują to, że produkcja wirusów może być dość czasochłonna i że komórki owadzie wymagają wymagających warunków hodowli podobnych do systemów ekspresji ssaków.

Bakteryjne systemy ekspresji

Gdy ktoś chce szybko i tanio wyprodukować duże ilości białka, bakteryjna komórka gospodarza jest prawie zawsze odpowiedzią. E. coli jest zdecydowanie jednym z najbardziej popularnych gospodarzy dla ekspresji białek z kilkoma szczepami, które są wyspecjalizowane do ekspresji białek. Ekspresja białka w bakteriach jest dość prosta; DNA kodujące interesujące nas białko jest wstawiane do plazmidowego wektora ekspresji, który następnie jest transformowany do komórki bakteryjnej. Transformowane komórki rozmnażają się, są indukowane do produkcji interesującego nas białka, a następnie lizowane. Białko może być następnie oczyszczone z pozostałości komórkowych.

Istnieje kilka popularnych wektorów DNA, które mogą być używane do produkcji dużych ilości białka w komórkach bakteryjnych: wektory pET, pRSET, Gateway pDEST, i pBAD na przykład. Ekspresja białka z każdego z tych wektorów jest kontrolowana przez inny promotor, co powoduje różne poziomy ekspresji z każdego wektora; niższa ekspresja może być wymagana, jeśli białko jest toksyczne dla E. coli. Ze wszystkich wektorów, pET, pod kontrolą promotora T7 lac i indukowany przez laktozę, zapewnia najwyższy poziom ekspresji białka.

Pomimo łatwości użycia, należy zauważyć, że bakterie zwykle nie mogą produkować funkcjonalnych wielodomenowych białek ssaków, ponieważ komórki bakteryjne nie są przystosowane do dodawania odpowiednich modyfikacji potranslacyjnych. Ponadto wiele białek produkowanych przez bakterie staje się nierozpuszczalnych, tworząc ciała wtrętowe, które są trudne do wyekstrahowania bez ostrych odczynników i cierpliwości.

Roślinne systemy ekspresji

Rośliny dostarczają tanich i mało zaawansowanych technicznie środków masowej ekspresji białek rekombinowanych. Wiele komórek z różnych rodzajów roślin, takich jak kukurydza, tytoń, ryż, trzcina cukrowa, a nawet bulwy ziemniaków, zostało wykorzystanych do ekspresji białek.

Systemy roślinne mają wiele z tych samych cech i wymagań dotyczących przetwarzania, co systemy ekspresji z komórek ssaków, w tym większość złożonych modyfikacji potranslacyjnych. Ekstrakcja i oczyszczanie białek rekombinowanych z roślin może być jednak kosztowne i czasochłonne, ponieważ tkanki roślinne same w sobie są złożone biochemicznie.

Aby obejść te problemy, naukowcy wykorzystali naturalne wydzielanie biochemikaliów i białek przez korzenie roślin. Oznaczanie rekombinowanych białek naturalnie wydzielanym peptydem roślinnym pozwala na łatwiejszy dostęp i oczyszczanie pożądanego białka. Pomimo, że jest to technologia dość młoda, komórki roślinne zostały wykorzystane do ekspresji szerokiej gamy białek, w tym przeciwciał i farmaceutyków, szczególnie interleukin.

Systemy ekspresji drożdży

Drożdże są doskonałym systemem ekspresji do generowania dużych ilości rekombinowanych białek eukariotycznych. Chociaż wiele gatunków drożdży może być używanych do ekspresji białek, S. cerevisiae, jest najbardziej niezawodnym i często używanym gatunkiem ze względu na jego zastosowanie jako organizmu modelowego w genetyce i biochemii.

Przy użyciu S. cerevisiae, badacze często umieszczają rekombinowane białka pod kontrolą promotora indukowanego galaktozą (GAL). Innymi powszechnie stosowanymi promotorami są fosforanowe i miedziowe promotory PHO5 i CUP1. Komórki drożdży są hodowane w dobrze zdefiniowanych pożywkach i mogą być łatwo przystosowane do fermentacji, co pozwala na stabilną produkcję białek na dużą skalę.

Ogólnie systemy ekspresji drożdży są łatwiejsze i tańsze do pracy niż komórki ssaków i często są zdolne do modyfikacji złożonych białek, w przeciwieństwie do systemów bakteryjnych. Komórki drożdży, jednakże, mają wolniejsze tempo wzrostu niż komórki bakteryjne i warunki wzrostu często muszą być zoptymalizowane. Komórki drożdży są również znane z hiperglikozylacji białek, co może stanowić problem w zależności od wybranego białka.

Systemy ekspresji bezkomórkowej

W systemach ekspresji bezkomórkowej białka są montowane in vitro przy użyciu oczyszczonych składników maszynerii transkrypcji i translacji. Obejmują one rybosomy, polimerazę RNA, tRNA, rybonukleotydy i aminokwasy. Systemy ekspresji bezkomórkowej są idealne do szybkiego montażu więcej niż jednego białka w jednej reakcji. Główną zaletą tych systemów jest ich zdolność do łączenia białek ze znakowanymi lub modyfikowanymi aminokwasami, które są przydatne w różnych zastosowaniach. Systemy ekspresji bezkomórkowej są jednak drogie i bardzo trudne technicznie w użyciu.

Alyssa D. Cecchetelli jest pracownikiem naukowym w Addgene. Otrzymała tytuł doktora na Northeastern University i jest szczególnie zainteresowana sygnalizacją komórkową i komunikacją. Uwielbia możliwość pomagania społeczności naukowej w dzieleniu się plazmidami.

Dodatkowe zasoby

• Thermofisher Protein Expression Systems
• Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges
• Produkcja białek rekombinowanych w wysiękach korzeniowych roślin

.