Chromosomy płciowe ssaków mają wyspecjalizowane role w męskim (XY) i żeńskim (XX) rozwoju komórek rozrodczych (1). Nieprawidłowości chromosomów płci są najczęstszą genetyczną przyczyną niepłodności u ludzi (2). W trisomiach chromosomów płciowych (SCTs) zespołu Klinefeltera (XXY) i podwójnego Y (XYY) spermatogeneza jest zaburzona odpowiednio przez nadmiar genów X i Y (2). Mężczyźni XYY są powszechnie płodni z powodu spontanicznej utraty dodatkowego chromosomu płciowego (mozaicyzm). U mężczyzn XXY mozaicyzm jest rzadszy. Pobranie spermy z jąder umożliwiło reprodukcję u niektórych młodych mężczyzn z zespołem Klinefeltera, ale jest mniej skuteczne u starszych pacjentów (3, 4). Osoby XXY i XYY bez komórek zarodkowych XY są niepłodne.

Aby zbadać niepłodność SCT, wygenerowaliśmy dorosłe myszy XXY i XYY niosące fluorescencyjne transgen Blimp1-mVenus (BV) i Stella-ECFP (SC) (5) w celu monitorowania różnicowania pluripotencjalnych komórek macierzystych do pierwotnych komórek zarodkowych (PGCLCs) (6). Samce XXY zostały stworzone przez kojarzenie samicy typu dzikiego z samcem z wariantem chromosomu płciowego, który produkuje plemniki zawierające XY (rys. S1). Wytworzenie myszy XYY wymaga dziedziczenia chromosomu Y od obojga rodziców. Dlatego użyliśmy ojcowsko dziedziczonego dzikiego chromosomu Y i matczynego chromosomu Yd1, który nie wykazuje ekspresji determinującego jądro Sry (fig. S1) (7). Jak wykazano wcześniej (8, 9), fenotyp spermatogenezy w obu modelach rekapitulował fenotyp u mężczyzn SCT, z zatrzymaniem na etapie prospermatogonialnym u myszy XXY i na pachynemie u myszy XYY (fig. S2). Spermatogeneza była normalna w euploidalnym rodzeństwie XY BVSC transgenic.

Następnie utworzyliśmy fibroblasty z SCT i kontrolnych myszy XY i XX (ryc. 1A). Fluorescencyjna hybrydyzacja in situ DNA (DNA-FISH) dla genu X Slx i genu Y Sly potwierdziła, że fibroblasty SCT i kontrolne w 4. pasażu (P4) zachowały swoje oryginalne chromosomy płciowe (ryc. 1B i fig. S3A). Fibroblasty przeprogramowano na indukowane pluripotencjalne komórki macierzyste (iPSCs) (10) w sposób indukowany doksycykliną (Dox). DNA-FISH przeprowadzono w powstałych w ten sposób P2 iPSCs (Ryc. 1A).

Wysoki odsetek linii iPSC pochodzących z SCT wykazywał utratę chromosomów płciowych. U myszy XXY zaobserwowano iPSC XY, XX i XO (ryc. 1, C i E). Częstość występowania utraty była podobna dla chromosomów X i Y (P = 0,062, test Manna-Whitneya). Z myszy XYY zaobserwowano iPSCs XY i XO (ryc. 1, D i E). Utrata chromosomu Y u samców XYY występowała z podobną częstością, jak ta obserwowana dla chromosomu X i Y łącznie u samców XXY (P = 0,089, test Manna-Whitneya). Następnie porównaliśmy częstość występowania utraty chromosomów płciowych między iPSC pochodzącymi z SCT a euploidalnymi iPSC pochodzącymi z XY- i XXY. Utrata chromosomów płciowych była bardziej powszechna w SCT- niż euploidalnych iPSC (Fig. 1E), niezależnie od wartości odcięcia użytej do zdefiniowania utraty chromosomów płciowych (fig. S12D).

Utrata chromosomów płciowych może wystąpić podczas przeprogramowania komórek SCT lub podczas propagacji iPSC do P2, być może nadając przewagę proliferacyjną powstałym komórkom euploidalnym. Rzeczywiście, niestabilność chromosomów płciowych została zaobserwowana w pluripotencjalnych komórkach macierzystych (11, 12). Aby sprawdzić tę ostatnią hipotezę, przeanalizowaliśmy stabilność chromosomów płciowych pomiędzy P2 i P6 w iPSCs z wysoce rodzicielskim (>90%) dopełnieniem (fig. S4A). Zaobserwowaliśmy utratę chromosomów płciowych w liniach XX i XXY iPSC (P < 0,01 i 0,05, odpowiednio; test Wilcoxon signed-rank), ale nie w liniach XY i XYY iPSC (P = 0,21 i 0,66, odpowiednio; test Wilcoxon signed-rank). Jednak żadna linia iPSC nie wykazała więcej niż 15% spadku w stosunku do dopełniacza rodzicielskiego (fig. S4B). Co więcej, utrata chromosomów płciowych między P2 a P6 nie była związana z trisomią (fig. S4B). Pochodzące z SCT euploidalne XY iPSCs również nie wykazywały przewagi proliferacyjnej nad XXY lub XYY iPSCs (fig. S5). Ponieważ fibroblasty SCT były również stabilne kariotypowo (Fig. 1B i Fig. S3A), utrata chromosomów jest prawdopodobnie indukowana podczas przeprogramowania iPSC, a zatem różni się od niestabilności chromosomów płciowych w pluripotencjalnych komórkach macierzystych (11, 12). Określamy to zjawisko jako utratę chromosomów trisomii (TCL).

Następnie określiliśmy, czy euploidalne XY iPSCs pochodzące z fibroblastów SCT będą tworzyć funkcjonalne plemniki. Wyselekcjonowaliśmy wysoce euploidalne (≥80% komórek XY) P6 iPSCs zaadaptowane do podłoża wolnego od Dox (fig. S6). W naszych eksperymentach z XYY, tylko linie XY iPSC, które zachowały chromosom Y typu dzikiego, a nie Yd1, zostały użyte do eksperymentów PGCLC (fig. S7). Kariotypowanie potwierdziło, że wszystkie linie XY iPSC pochodzące z SCT oraz kontrolna linia XY iPSC były euploidalne (fig. S8). Te linie iPSC były różnicowane (6) przez stan podobny do epiblastu, aby utworzyć agregaty PGCLC pozytywne dla BV i SC (Fig. 2A). BV-pozytywne PGCLCs (tabela S1) zostały wyizolowane przez sortowanie komórek aktywowane fluorescencją (FACS) (Figura 2B) i przeszczepione do jąder z niedoborem komórek płciowych W/Wv (mutant Kit) (13).

Spermatogeneza u biorców została oceniona 9 do 10 tygodni po transplantacji. Teratomy, które obserwuje się po transplantacji PGCLC pochodzących z iPSC (6), były obecne w 29% linii przeszczepionych XXY-pochodzących i 50% linii przeszczepionych XYY-pochodzących (fig. S9). Rekonstytucja spermatogenezy, ujawniona przez obecność kolonii spermatogenicznych (ryc. 2C) i histologicznie (ryc. 2D), była obserwowana dla wszystkich użytych linii iPSC pochodzących z XXY- i XYY- (tab. 1). Tak więc, SCT-derived XY iPSCs mogą różnicować się do komórek płciowych in vitro i zakończyć spermatogenezę po transplantacji.

Pytaliśmy, czy plemniki utworzone poprzez transplantację mogą wspierać reprodukcję. Intracytoplazmatyczna iniekcja spermy (ICSI) z użyciem plemników z dwóch XXY- i dwóch XYY- pochodzących z linii XY iPSC (ryc. 2E i ryc. S10A) wygenerowała zygoty, które rozwinęły się w dwukomórkowe zarodki in vitro (wydajność 76.7 do 87,3%) (ryc. 2F, ryc. S10B i tabela S2) i rażąco normalne potomstwo po przeszczepieniu do biorców (wydajność 46,9 do 59,4%) (ryc. 2G, ryc. S10C i tabela S2). Genotypowanie w reakcji łańcuchowej polimerazy potwierdziło, że potomstwo pochodziło z przeszczepionych PGCLCs (fig. S10D). Szczenięta z linii iPSC pochodzących z XXY- i XYY wykazywały porównywalny wzrost do tych pochodzących z kontrolnych XY iPSC (fig. S10E). Warto zauważyć, że szczenięta pochodzące z linii XXY- i XYY miały euploidalne (XY lub XX) dopełnienia (fig. S11). Trzy dojrzałe samce i trzy samice z każdej linii XXY- i XYY-pochodzącej z iPSC zostały skojarzone ze sobą i wszystkie były płodne (ryc. 2H i ryc. S10F). Tak więc, plemniki z SCT-pochodzące z XY iPSCs dają początek chromosomalnie normalnemu, zdrowemu i płodnemu potomstwu.

Zajęliśmy się tym, czy TCL jest specyficzny dla trisomii chromosomów płci. Ponieważ modele myszy z trisomią dla kompletnego autosomu nie są dostępne (14), powtórzyliśmy nasze eksperymenty na samcach myszy Tc1 transchromosomicznych, modelu zespołu Downa z dodatkowym ludzkim chromosomem 21 (hChr.21) (15). Myszy Tc1 noszą kasetę oporności na neomycynę wstawioną do hChr.21, której selekcja redukuje mozaikowatość hChr.21 (15). Dlatego najpierw wzbogaciliśmy dorosłe fibroblasty Tc1 na obecność hChr.21 za pomocą analogu neomycyny G418 (Fig. 3A). DNA-FISH wykazało, że zdecydowana większość (≥96%) fibroblastów Tc1 zachowała hChr.21 (ryc. 3B i ryc. S3B). Te fibroblasty Tc1 przeprogramowano bez selekcji G418, a powstałe w ten sposób iPSC poddano analizie w P2. Dziesięć z 16 wygenerowanych linii iPSC (62,5%) wykazało utratę hChr.21 w ≥10% komórek (ryc. 3, C i D oraz ryc. S12D). W przeciwieństwie do tego, po usunięciu G418, hChr21 został zachowany w fibroblastach Tc1 hodowanych przez ten sam okres, który został użyty do przeprogramowania iPSC (18 dni) i w liniach P6 iPSC, które miały wysoce rodzicielskie (>90% pozytywnych hChr.21) dopełniacze w P2 (fig. S12, A i B). Wnioskujemy, że utrata hChr.21 w komórkach Tc1 jest promowana przez przeprogramowanie, a nie usunięcie G418, a zatem, że TCL wpływa również na chromosom akcesoryjny.

Następnie zapytaliśmy, czy TCL występuje w komórkach ludzkich. Przypadki utraty chromosomów zostały zaobserwowane podczas hodowli ludzkich komórek trisomicznych (16, 17), ale ich częstość występowania i związek z przeprogramowaniem nie był systematycznie analizowany. Wyselekcjonowaliśmy ludzkie linie fibroblastów z zespołem Klinefeltera, zespołem Downa oraz euploidalne linie XY i XX wykazujące minimalny mozaicyzm (fig. S13, A i D), przeprogramowaliśmy je i określiliśmy kompletność chromosomów powstałych w ten sposób linii iPSC. Zaobserwowaliśmy iPSC XY i XX z fibroblastów zespołu Klinefeltera oraz euploidalne iPSC z fibroblastów zespołu Downa (fig. S13, B, C, F, i G). Utrata chromosomów była częstsza w komórkach trisomicznych niż disomicznych, co dowodzi, że TCL występuje również podczas ludzkiego przeprogramowania. Jednak częstotliwość wysoce euploidalnych linii iPSC była niższa niż obserwowana w mysich iPSC pochodzących z trisomii (fig. S13, F do H).

Wykazaliśmy, że TCL wytwarza euploidalne iPSC z SCT i autosomalnych trisomicznych myszy i pacjentów (fig. S12E). U myszy, powstałe „skorygowane” iPSCs mogą tworzyć funkcjonalne plemniki, umożliwiając produkcję chromosomalnie euploidalnego potomstwa od niepłodnych osobników SCT. TCL uzupełnia istniejące terapie iPSC dla nieprawidłowości chromosomowych (17-21). Mechanizmy wywołujące TCL nie są znane. Stresy komórkowe związane z przeprogramowaniem mogą selekcjonować komórki trisomiczne, umożliwiając pojawienie się komórek euploidalnych. Zaobserwowaliśmy rzadsze występowanie TCL w komórkach ludzkich niż w mysich (fig. S12D i S13H). Nawet jeśli rzadko, TCL może zaoferować leczenie dla niepłodnych pacjentów SCT, dla których alternatywne podejścia są nieskuteczne. Jednakże kliniczne zastosowanie ludzkich komórek zarodkowych wytworzonych in vitro powinno być starannie rozważone pod względem etycznym i prawnym (22-24). Ponadto, całkowita spermatogeneza in vitro będzie musiała zostać opracowana, aby uniknąć ryzyka powstania teratoma w wyniku transplantacji komórek zarodkowych.

TCL pozwala również na produkcję żeńskich iPSC od samców, oferując potencjał do genetycznej dysekcji dymorfizmu płciowego (25). Poprzez tworzenie izogenicznych linii iPSC, które różnią się tylko w odniesieniu do ich chromosomów płciowych, różnice płci zidentyfikowane podczas modelowania choroby iPSC można przypisać efektom chromosomalnym X lub Y.