Generacja myszy nokautujących

Technologie stosowane do generowania myszy nokautujących obejmują rekombinację homologiczną (lub ukierunkowanie genów) i pułapkowanie genów. Oba podejścia obejmują wykorzystanie mysich embrionalnych komórek macierzystych (ES), które są izolowane z embrionów myszy w około cztery dni po zapłodnieniu. W pierwszym podejściu, rekombinacji homologicznej, sztuczne DNA z sekwencjami bocznymi, które są homologiczne (identyczne) do tych występujących przed i za sekwencją DNA docelowego genu jest wprowadzane do jądra mysiej komórki ES. Komórka ES rozpoznaje homologiczne sekwencje flankujące i wymienia istniejące DNA genu docelowego na odcinki obcego DNA. Obce DNA jest jednak nieaktywne. Tak więc, jego włączenie do genomu komórki ES inaktywuje, lub wybija, gen docelowy. Obce DNA jest zazwyczaj zaprojektowane w taki sposób, aby przenosić gen reporterowy, który zaznacza lub oznacza miejsce istniejącego genu, umożliwiając badaczom śledzenie jego obecności w genomie komórek myszy w miarę replikacji komórek. Rekombinacja homologiczna jest metodą z wyboru, gdy wymagane jest, aby określony allel (gen) został zastąpiony przez zmodyfikowaną sekwencję DNA bez wpływu na inne geny w genomie.

Wyłapywanie genów również wykorzystuje sztuczne DNA, które niesie gen reporterowy. Jednakże, zamiast ukierunkowywać się na konkretny gen, obce DNA jest losowo włączane do dowolnego genu w genomie komórek ES myszy. Obca sekwencja uniemożliwia zakłóconemu genowi kodowanie jego produktów białkowych, przez co gen staje się nieaktywny. Aktywacja genu reporterowego po włączeniu do genomu komórek ES umożliwia badaczom śledzenie aktywności genu i wnioskowanie o funkcji zaburzonego genu.

Sekwencje sztucznego DNA są zwykle wprowadzane do mysich komórek ES za pomocą retrowirusa lub innego wektora wirusowego, a zmodyfikowane komórki ES są następnie hodowane w hodowlach komórkowych. Po kilku dniach komórki są wstrzykiwane do wczesnych embrionów myszy, które następnie są wszczepiane do macicy zastępczej samicy, gdzie ostatecznie rozwijają się i są noszone do terminu. Urodzone w ten sposób szczenięta myszy zawierają zarówno zmodyfikowaną, jak i niezmodyfikowaną tkankę, a zatem nie są to myszy całkowicie pozbawione mutacji. W celu wygenerowania pary prawdziwych myszy nokautujących (homologicznych nokautów), myszy muszą być hodowane przez kilka pokoleń. Początkowo zwierzęta są krzyżowane z innymi myszami w celu uzyskania osobników heterozygotycznych (myszy z jedną kopią docelowego genu); zwierzęta heterozygotyczne są następnie krzyżowane w celu uzyskania osobników homozygotycznych.