Modafinil Effects on Behavior and Oxidative Damage Parameters in Brain of Wistar Rats
Abstract
Oceniono wpływ modafinilu (MD) na zachowanie oraz uszkodzenia oksydacyjne białek i lipidów w mózgu szczurów. Szczurom Wistar podawano jednorazowo przez zgłębnik wodę lub MD (75, 150, lub 300 mg/kg). Parametry behawioralne oceniano w warunkach otwartego pola 1, 2 i 3 h po podaniu leku. W mózgu mierzono poziom substancji reaktywnych kwasu tiobarbiturowego (TBARS) i tworzenie się karbonylu w białkach. MD w najwyższej dawce zwiększał aktywność lokomotoryczną po 1 i 3 h od podania. Podanie MD w dawce 300 mg/kg zwiększyło liczbę wizyt w centrum otwartego pola po 1 h od podania, jednak po 3 h od podania wszystkie podane dawki MD zwiększyły liczbę wizyt w centrum otwartego pola. MD 300 mg/kg zwiększał uszkodzenia lipidów w amygdali, hipokampie i striatum. Ponadto MD zwiększał uszkodzenia białek w korze przedczołowej, amygdali i hipokampie, jednak efekt ten jest różny w zależności od podanej dawki. Natomiast podawanie MD w dawkach 75 i 300 mg/kg zmniejszało uszkodzenie białek w striatum. Badanie to wykazało, że podanie MD wywołuje zmiany behawioralne, które były zależne od zastosowanej dawki. Ponadto, wpływ MD na parametry uszkodzenia oksydacyjnego wydawał się być w określonym regionie mózgu i w określonych dawkach.
1. Wprowadzenie
Modafinil (MD) jest nieamfetaminergicznym lekiem psychoaktywnym często przepisywanym do leczenia zaburzeń snu, takich jak narkolepsja, zespół obturacyjnego bezdechu sennego i zaburzenia snu związane z pracą zmianową. Ponadto w literaturze dobrze opisano, że MD poprawia funkcjonowanie w wielu domenach poznawczych, a także pamięć roboczą i pamięć epizodyczną. Ten wpływ MD na pamięć opisano również u pacjentów psychiatrycznych, co sugeruje, że lek ten jest doskonałym kandydatem do leczenia zaburzeń funkcji poznawczych w zaburzeniach psychiatrycznych. Ponadto badania kliniczne wykazały, że MD poprawia objawy u pacjentów z dużą depresją, chorobą dwubiegunową, schizofrenią i zespołem nadpobudliwości psychoruchowej z deficytem uwagi (ADHD).
Mechanizm działania MD jest słabo poznany; wiadomo jednak, że lek ten ma istotny wpływ na układy katecholamin, serotoniny, glutaminianu, kwasu gamma aminomasłowego, oreksyny i histaminy w mózgu. Poza tym badania pokazują, że MD hamuje transporter dopaminy, zwiększając neurotransmisję dopaminergiczną w obwodach czuwania. Wykazano, że środki psychostymulujące, takie jak amfetamina, które również działają na różne układy neuroprzekaźników, mają wyraźny wpływ na zachowanie, w tym generowanie strachu, niepokoju i nadpobudliwości. Jednak MD jest mniej związane z działaniami niepożądanymi, takimi jak nadpobudliwość, niepokój, nerwowość, lub efekty odbicia niż tradycyjne stymulanty .
Szczególne badania sugerowały, że podawanie psychostymulantów może prowadzić do stresu oksydacyjnego w mózgu szczura. Mózg jest szczególnie podatny na reaktywne formy tlenu (ROS) produkcji, ponieważ metabolizuje 20% całkowitego tlenu ciała i ma ograniczoną ilość zdolności antyoksydacyjnych . Przewlekłe podawanie środków psychostymulujących, takich jak metylofenidat, m-amfetamina i d-amfetamina u szczurów wywołało zwiększoną produkcję nadtlenków, uszkodzenia oksydacyjne białek, lipidów i DNA oraz zmiany w enzymach antyoksydacyjnych i kompleksach mitochondrialnego łańcucha oddechowego.
W związku z tym, celem niniejszej pracy była ocena wpływu MD na zachowanie i parametry stresu oksydacyjnego w hipokampie, korze przedczołowej, migdałku i prążkowiu szczurów.
2. Metody eksperymentalne
2.1. Animals
The subjects were adult male Wistar rats (weighting 250-350 g) obtained from our breeding colony. Zwierzęta były trzymane jako pięć w klatce z jedzeniem i wodą dostępną ad libitum i były utrzymywane w cyklu światło/ciemność 12 h (światła włączone o 7:00 rano) w temperaturze °C. Wszystkie procedury doświadczalne przeprowadzono zgodnie z zatwierdzeniem lokalnej komisji etycznej ds. wykorzystywania zwierząt na Universidade do Extremo Sul Catarinense. Wszystkie eksperymenty przeprowadzono w tym samym czasie w ciągu dnia, aby uniknąć zmian okołodobowych.
2.2. Leki i procedury farmakologiczne
Wóz MD (Libbs Farmacêutica Ltda) był zawieszony w pojeździe-nośniku: 1% metylocelulozy w wodzie. Roztwory zostały przygotowane bezpośrednio przed użyciem i były chronione przed światłem podczas sesji eksperymentalnej. Zawiesina była mieszana przez cały czas trwania iniekcji. Grupa kontrolna otrzymała nośnik.
2.3. Projekt eksperymentalny
Całkowita liczba szczurów użytych w tym eksperymencie wynosiła 40 ( zwierząt w każdej grupie). Zwierzęta otrzymały pojedynczą dawkę MD (75, 100, lub 300 mg/kg masy ciała) w objętości 1 mL/kg, podawaną przez zgłębnik. Grupa kontrolna otrzymywała nośnik w objętości 1 mL/kg. Aktywność lokomotoryczną mierzono 1, 2 i 3 h po wstrzyknięciu, a szczury uśmiercano przez dekapitację zaraz po wykonaniu zadania w otwartym polu.
2.4. Aktywność lokomotoryczna
Aktywność lokomotoryczna została oceniona przy użyciu zadania otwartego pola, jak opisano wcześniej. Zadanie to wykonywano w otwartym polu o wymiarach 40 × 60 cm, otoczonym ścianami o wysokości 50 cm, wykonanymi z brązowej sklejki, z podłogą podzieloną czarnymi liniami na 9 równych kwadratów. Zwierzęta delikatnie umieszczano na lewym tylnym prostokącie i pozostawiano na 5 minut, aby mogły swobodnie eksplorować arenę. W teście otwartego pola oceniano następujące parametry behawioralne.
Przejścia (aktywność lokomotoryczna/aktywność pozioma): zliczano całkowitą liczbę kwadratów przekroczonych przez szczury w całym okresie testowym.
Przejścia (aktywność eksploracyjna/aktywność pionowa): zliczano całkowitą postawę wyprostowaną szczurów w całym okresie testowym.
Wizyty w centrum otwartego pola: zliczano całkowitą liczbę wizyt w centrum otwartego pola. Kwadrat o boku cm był definiowany jako obszar „centrum” pola.
2.5. Pomiar markerów uszkodzeń oksydacyjnych
Szczury poddano działaniu MD lub wody, jak opisano powyżej, i zabito przez dekapitację 3 h po ostatniej iniekcji, a ich mózgi usunięto i rozczłonkowano w celu oceny poziomu uszkodzeń oksydacyjnych w korze przedczołowej, migdałach, hipokampie i prążkowiu. TBARS i formacje karbonylowe białka były mierzone jak wcześniej opisano .
2.6. Substancje Reaktywne Kwasu Tiobarbiturowego (TBARS)
Tworzenie TBARS podczas reakcji ogrzewania kwasem było mierzone jako wskaźnik produkcji ROS, który jest powszechnie przyjęty jako czuła metoda pomiaru peroksydacji lipidów, jak wcześniej opisano . Krótko mówiąc, próbki zmieszano z 1 mL kwasu trójchlorooctowego 10% (TCA) i 1 mL kwasu tiobarbiturowego 0,67% (TBA), a następnie ogrzewano we wrzącej łaźni wodnej przez 15 min. TBARS oznaczano za pomocą absorbancji przy 535 nm. Wyniki wyrażono jako równoważniki MDA (malondialdehydu) (nmol/mg białka).
2.7. Pomiar karbonyli białkowych
Uszkodzenia oksydacyjne białek oceniano poprzez oznaczanie grup karbonylowych na podstawie reakcji z dinitrofenylohydrazyną (DNPH), jak opisano wcześniej. W skrócie, białka wytrącano przez dodanie 20% kwasu trójchlorooctowego i ponownie rozpuszczano w DNPH, a absorbancję odczytywano przy 370 nm.
2.8. Analiza statystyczna
Wszystkie analizy przeprowadzono przy użyciu pakietu statystycznego dla nauk społecznych w wersji 19.0 (SPSS Inc., Chicago, IL, USA). Wszystkie dane przedstawiono jako średnie ± SEM. Różnice między grupami w analizie behawioralnej weryfikowano za pomocą analizy wariancji z powtarzanymi środkami w celu uzyskania dostępu do krzywej odpowiedzi czasowej, a następnie testami post hoc Tukeya. W celu sprawdzenia różnic między grupami w analizie biochemicznej zastosowano ANOVA, a następnie testy post hoc Tukeya. We wszystkich eksperymentach wartości < 0,05 były uznawane za wskazujące na istotność statystyczną.
3. Wyniki
3.1. Analiza zachowania
Dla analizy lokomocji (przejścia) (Rysunek 1(a)), analiza wariancji metodą powtarzanych środków wykazała istotne różnice dla podawania MD (F(3,35) = 7,91, ) oraz dla powtórzeń behawioralnych (F(2,7) = 54,82, ). Dalsza analiza z testem post hoc Tukeya wykazała, że MD w dawce 300 mg/kg zwiększył spontaniczną lokomocję szczurów w porównaniu z grupą kontrolną 1 h po podaniu. Ponadto, grupa kontrolna, MD w dawce 75 mg/kg i MD w dawce 150 mg/kg wykazywały zmniejszoną liczbę przejść, gdy były ponownie wystawione na działanie otwartego pola 3 h później, wskazując w ten sposób na przyzwyczajenie do środowiska. Jednakże, szczury poddane działaniu MD w dawce 300 mg/kg wykazywały zmniejszoną liczbę przejść, gdy były ponownie wystawione na działanie otwartego pola 2 i 3 godziny później. Różnica ta może być wyjaśniona przez nadpobudliwość ruchową wywołaną 1 h po podaniu MD w dawce 300 mg/kg.
(a)
(b)
(c)
(a)
(a)
(b)
(c)
W przypadku analizy eksploracji (rearings) (Rysunek 1(b)), powtarzana analiza środków wariancji wykazała istotne różnice dla powtórzeń behawioralnych (F(2,7) = 32,7, ). Dalsza analiza z testem post hoc Tukey’a wykazała, że grupa kontrolna, MD w dawce 75 mg/kg i MD w dawce 150 mg/kg wykazały zmniejszoną liczbę powtórzeń przy ponownej ekspozycji na otwarte pole 3 godziny później. MD w dawce 300 mg/kg zmniejszyło liczbę cofnięć przy ponownej ekspozycji 2 i 3 godziny później na otwarte pole.
Dla analizy wizyt w centrum otwartego pola (rysunek 1(c)), wielokrotna analiza wariancji wykazała znaczące różnice dla podawania MD (F(3.34) = 15.70, ). Dalsza analiza z testem post hoc Tukey’a wykazała, że MD w dawce 300 mg/kg zwiększył liczbę wizyt w centrum otwartego pola w porównaniu z kontrolą 1 h po podaniu. Ponadto, MD we wszystkich podawanych dawkach zwiększało wizyty w centrum otwartego pola 3 h po podaniu.
3.2. Biochemical Analysis
As shown in Figure 2(a), TBARS levels were significantly increased in the amygdala (F(3) = 4.18, ), hippocampus (F(3) = 44.9, ), and striatum (F(3) = 7.07, ) of rats treated with MD at 300 mg/kg as compared to control group.
(a)
(b)
(a)
(b)
(a)
(b)
Jak można zaobserwować na rysunku 2(b), znaczący wzrost wytwarzania karbonylu wykryto po podaniu MD w korze przedczołowej (F(3) = 29,9, ) w dawce 300 mg/kg oraz w amygdali (F(3) = 9,74, ) i hipokampie (F(3) = 17,99, ) w dawce 75 mg/kg. Odwrotnie, leczenie MD w dawkach 75 i 300 mg/kg znacząco zmniejszyło generowanie karbonylu w striatum (F(3) = 21,93, ) w porównaniu do grupy kontrolnej.
4. Dyskusja
W obecnym badaniu zaobserwowaliśmy, że pojedyncze wstrzyknięcie MD w wysokiej dawce (300 mg/kg) indukuje hiperlokomocję u szczurów, która nie utrzymuje się 2 i 3 godziny po podaniu. Zgodnie z naszymi wynikami, MD znacząco zwiększał aktywność lokomotoryczną i zwiększał poziom zewnątrzkomórkowej dopaminy w prążkowiu u małp rhesus. Young i współpracownicy wykazali, że MD zwiększył aktywność, wychowanie i gładkość ścieżek lokomotorycznych u myszy C57BL/6J i 129/SJ. Te zmiany zachowania wywołane przez MD były związane ze zwiększoną dopaminą synaptyczną i wtórnymi działaniami mediowanymi przez receptory dopaminowe drd1 i drd4. W przeciwieństwie do powyższego badania, w tym przypadku nie obserwujemy znaczącego wzrostu zachowań eksploracyjnych po podaniu MD. Ta rozbieżność może być wyjaśniona przez różnice w metodologii, gatunków i czasu leczenia.
Tutaj, zaobserwowaliśmy, że grupa kontrolna i MD w niskich dawkach (75 i 150 mg/kg) zmniejszyła liczbę przekroczeń i rearings, gdy ponownie narażone 3 godziny później do otwartego pola, wskazując przyzwyczajenia do środowiska. MD w wysokiej dawce (300 mg/kg) zmniejszał liczbę przejść i odrzutów przy ponownej ekspozycji na otwarte pole po 2 i 3 godzinach. Ta rozbieżność może być wyjaśniona przez fakt, że 1 h po podaniu MD (300 mg/kg) znacznie zwiększyła się liczba przejść i tendencja do zwiększenia liczby odrzutów. Uważa się, że habituacja do nowego środowiska jest jedną z najbardziej elementarnych form uczenia się nieasocjacyjnego. Powtarzająca się ekspozycja na to samo środowisko wywołuje redukcję zachowań eksploracyjnych, które mogą być traktowane jako wskaźnik przyzwyczajenia .
Ciekawym odkryciem obecnego badania było to, że MD modulował zachowania związane z lękiem. W teście otwartego pola, szczury traktowane MD były mniej niespokojne, a nawet miały tendencję do badania awersyjnego obszaru centrum więcej niż kontrole. MD w dawce 300 mg/kg zwiększał liczbę wizyt w centrum otwartego pola 1 h po podaniu. Ponadto, MD we wszystkich podawanych dawkach zwiększał liczbę wizyt w centrum otwartego pola 3 h po podaniu. W piśmiennictwie istnieją kontrowersyjne badania dotyczące wpływu MD na lęk. Badania przedkliniczne wykazały albo brak wpływu modafinilu na lęk, albo działanie anksjolityczne. Podobnie, MD w badaniach klinicznych wykazuje albo działanie anksjolityczne, albo brak wpływu na lęk, podczas gdy inne wykazują działanie anksjogenne. Ta różnica między badaniami może być wyjaśniona przez różnice w stosowanych dawkach (100 mg, 200 mg lub 400 mg) oraz w schemacie dawkowania (dawkowanie jednorazowe w porównaniu z dawkowaniem przewlekłym przez tydzień lub dłużej). Anksjolityczne działanie MD można wyjaśnić jego wpływem na amygdala, który jest regionem mózgu zaangażowanym w lęk, na bodźce zagrażające. Poprzednie badanie wykazało, że MD zmniejsza reaktywność amygdali na bodźce wywołujące lęk. Wiadomo, że migdałek jest bogaty w katecholaminergiczne i serotoninergiczne projekcje, a następnie prawdopodobnie MD zmniejsza reaktywność migdałka przez zmiany w sygnalizacji wewnątrz migdałka wynikające ze zmian w systemach noradrenaliny, dopaminy, serotoniny lub GABA lub z kombinacji tych efektów.
W uzupełnieniu do wywoływania zmian behawioralnych, jest dobrze opisane w literaturze, że psychostymulanty powodują uszkodzenia oksydacyjne zarówno w modelach zwierzęcych, jak i u ludzi. Nasze wyniki pokazują, że MD zwiększa uszkodzenia oksydacyjne lipidów i białek w mózgu szczurów. Poziom TBARS był zwiększony w amygdali, hipokampie i striatum szczurów leczonych MD w wysokiej dawce (300 mg/kg). Ponadto zaobserwowano wzrost generowania karbonylu po podaniu MD w korze przedczołowej w dawce 300 mg/kg oraz w korze migdałowej i hipokampie w dawce 75 mg/kg. Badania wykazują, że MD hamuje transporter dopaminy, zwiększając neurotransmisję dopaminergiczną. Wzrost zewnątrzkomórkowego stężenia dopaminy wywołany przez MD może indukować nadprodukcję toksycznego metabolitu oksydacji dopaminy, co prowadzi do oksydacyjnego uszkodzenia białek i lipidów w mózgu szczurów. W literaturze nie ma badań oceniających uszkodzenie mózgu po podaniu MD; badania te są jednak bardzo ważne, biorąc pod uwagę, że dostępność MD, takich jak alertness-enhancing, memory-enhancing i antifatigue drug, dla zdrowych ludzi jest coraz większa .
Odwrotnie, leczenie MD (75 i 300 mg/kg) zmniejszyło generację karbonylu w striatum w porównaniu z grupą kontrolną. Niektóre badania wykazały potencjał neuroprotekcyjny striatalnej MD. Poprzednie badania wykazały poprawę przeżywalności neuronów dopaminergicznych zatoksycznionych 1-metylo-1,2,3,6-tetrahydropirydyną w prążkowiu po leczeniu MD, w zwierzęcym modelu choroby Parkinsona. Raineri i współpracownicy wykazali, że podawanie MD osłabiło neurotoksyczność wywołaną metamfetaminą w striatum myszy, sugerując możliwą ochronną rolę MD w tym regionie mózgu. Wykazano, że MD poprawia uczenie się u pacjentów uzależnionych od metamfetaminy. Przedstawione tutaj wyniki sugerują, że podawanie MD może wykazywać właściwości antyoksydacyjne w striatum, jednak ochronny wpływ MD na striatum jest nadal nieznany. Striatum integruje wejścia glutamatergiczne z kory mózgowej i wzgórza z dopaminergicznymi aferentami z śródmózgowia. Sygnalizacja dopaminowa odgrywa pierwszoplanową rolę w zależnym od striatum uczeniu się oraz w plastyczności synaptycznej neuronów projekcyjnych typu medium spiny. Rossato i współpracownicy wykazali, że infuzja agonisty receptora D1 zwiększyła poziom czynnika neurotroficznego pochodzenia mózgowego (BDNF) i w konsekwencji plastyczność synaptyczną. Tak więc MD może promować plastyczność synaptyczną poprzez aktywację układu dopaminergicznego i w konsekwencji ochronę striatum przed uszkodzeniem oksydacyjnym.
W podsumowaniu, jesteśmy w stanie wykazać, że (1) MD indukuje nadpobudliwość w wysokiej dawce (300 mg/kg) 1 h po podaniu, która nie pozostaje 2 i 3 godziny po podaniu. (2) MD wykazał efekty anksjolityczne u szczurów, zwiększając liczbę wizyt w centrum otwartego pola. (3) MD indukował uszkodzenia oksydacyjne lipidów i białek w mózgu szczurów; jednak uszkodzenia oksydacyjne zależą od analizowanego regionu mózgu i dawki podawanego MD. (4) Wreszcie, MD może chronić striatum przed uszkodzeniem oksydacyjnym białek. Należy zachować ostrożność przy interpretacji tych wyników. Po pierwsze, nie mierzono obrony antyoksydacyjnej; ponieważ jest to pierwsze badanie badające wpływ MD na stres oksydacyjny, przyznajemy, że mogłoby to pomóc w interpretacji wyników. Jednakże, po drugie, MD podawano zdrowym szczurom; wpływ MD na uszkodzenia oksydacyjne w zwierzęcych modelach chorób psychicznych może wykazywać inne wyniki.
Konflikt interesów
Autorzy deklarują, że nie ma konfliktu interesów dotyczącego publikacji tej pracy.
Podziękowania
Laboratory of Neurosciences (Brazylia) jest jednym z ośrodków National Institute for Translational Medicine (INCT-TM) i jednym z członków Center of Excellence in Applied Neurosciences of Santa Catarina (NENASC). Badania te były wspierane przez granty z CNPq, FAPESC, Instituto Cérebro e Mente oraz UNESC. João Quevedo jest stypendystą CNPq, Roger B. Varela, Wilson R. Resende, i Amanda V. Steckert są posiadaczami stypendium CAPES; Samira S. Valvassori jest posiadaczką stypendium CNPq.
.