Wyniki i dyskusja

Badano struktury i energie różnych zmutowanych układów modelowych KSI wzdłuż trzech etapów reakcji: pierwszy, abstrakcja protonu C4-β (ES → TS1 → EI1); drugi, nieznaczna rotacja protonowanego Asp-40 (EI1 → TS2 → EI2); i trzeci, donacja protonu do pozycji C6-β przez Asp-40 (EI2 → TS3 → EP), jak pokazano na Rys. 1. Przewidywany profil energetyczny WT (Rys. 2A) jest podobny do odpowiadającego mu profilu doświadczalnego Pollacka i współpracowników (25). Należy zauważyć, że przy TS2 substrat jest częściowo neutralizowany, ponieważ atomy H reszt katalitycznych zbliżają się do oksyanionu (O3) w substracie, a nadmiar elektronów przenosi się z substratu na sąsiednie reszty katalityczne poprzez ścieżki wiązań H. W ten sposób substrat, Tyr-16/57 i Asp-103 dziel± jedn± ujemn± jednostkę ładunkow±, a rozkład ich ładunków zależy od powinowactwa protonowego i elektronowego reszt katalitycznych mutantów. Ten stan TS2 z resztami katalitycznymi jest przeciwstawiony temu bez reszt katalitycznych, gdzie substrat jest ujemnie naładowany prawie o jedną jednostkę.

Obliczone przez nas trójwymiarowe struktury EIs (skompleksowanych z equileniną zamiast steroidu) niemal dokładnie pasują do struktur rentgenowskich PI(g′) i TI(g′). W przewidywanej strukturze kompleksu Tyr-16/57 + Asp-103 + equilenin, dwie odległości d(O3-Or) dla Tyr-16 i Asp-103 (odpowiednio 2.54 i 2.55 Å) są w dobrej zgodności z danymi rentgenowskimi (2.6 ± 0.1 Å dla obu w przypadku PI oraz 2.58 ± 0.08 Å i 2.62 ± 0.07 Å, odpowiednio, w przypadku TI) (32, 33, 36). Ponieważ obliczone struktury zostały zoptymalizowane bez ograniczeń, zgodność w eksperymentalnych i teoretycznych geometriach wskazuje, że w enzymie kluczowe reszty mają prawie maksymalne interakcje z substratem bez naprężeń.

Przewidywano, że w roztworze miejsce aktywne TI może mieć strukturę dyadyczną (Asp-99… Tyr-14… equilenin) (29), która różni się od struktur rentgenowskich TI i PI (32, 33). Jednakże, ostatni eksperyment NMR dla PI/equilenin wykazał, że w PI(D40N)/equilenin pojawia się charakterystyczny silny rezonans w dół pola przy 16.8 ppm, a słaby przy 13.1 ppm (36), podobnie jak w przypadku TI/equilenin przez grupy Mildvan (29) i Pollack (25). Wynik ten potwierdzają również nasze obliczenia ab initio kompleksu Tyr-16/57 + Asp-103 + equilenin, w którym silny rezonans w dół pola przy 16.5 ppm przypisany jest Tyr-16. Eksperyment pokazuje również, że w mutancie D103L + D40N pojawia się silny rezonans w dół pola (przypisany Tyr-16), natomiast w mutancie Y16F + D40N silny rezonans zanika. Tak więc, ten eksperyment wyraźnie wyklucza strukturę dyadyczną, w której silny rezonans w dół pola był przypisany do Asp-103, który jest związany wiązaniem H z Tyr-16 (36).

Bezwzględne stałe szybkości mogą być zbadane przy użyciu obliczonych barier aktywacji. Na poziomach B3LYP/6-31+G* i MP2/6-31+G* bariera aktywacji WT KSI jest nieco niedoszacowana, w porównaniu do bariery eksperymentalnej (10 do ≈11 kcal/mol) podanej przez Pollacka i współpracowników (46). Jednakże, gdy uwzględni się efekt ośrodka dielektrycznego KSI (31), bariera aktywacji WT wynosi 8.2 kcal/mol, co jest zgodne z wartością eksperymentalną. Nieznaczne niedoszacowanie o 2-3 kcal/mol można wyjaśnić dokładniejszymi obliczeniami i bardziej kompletnym systemem modelowym, obejmującym reszty apolarne wokół miejsca aktywnego. W przeciwieństwie do bezwzględnej bariery aktywacji, względne bariery aktywacji pomiędzy różnymi mutantami, a tym samym mechanizm reakcji, są dość spójne niezależnie od poziomu obliczeń ze względu na efekt anulowania pomiędzy różnymi systemami modelowymi o podobnych środowiskach. Tak więc, używając względnych barier aktywacji pomiędzy różnymi mutantami, uzyskaliśmy względną reaktywność (stosunek kinetycznej stałej szybkości mutanta do stałej szybkości WT) lub log(kcat/kcat(WT)) przy założeniu, że przeniesienie z ES do TS1 jest krokiem determinującym szybkość reakcji (patrz przypis w Tabeli 1). Obliczenia MP2 wzmacniają wyniki uzyskane na poziomie B3LYP. Przewidywane wartości log(kcat/kcat(WT)) są w dobrej zgodności z wartościami zmierzonymi dla PI (32-35) i TI (25-28, 31) (Tabela 1). Biorąc pod uwagę, że wysoce homologiczne struktury trójwymiarowe (trzecio- i czwartorzędowe) oraz środowisko miejsca aktywnego TI są podobne do PI, można się spodziewać, że reakcje katalityczne w tych dwóch KSI przebiegają w ten sam sposób.

Fig. 2 przedstawia profile energii i odległości wiązań H dla różnych mutantów wzdłuż ścieżki reakcji. Ogólne profile energetyczne (ΔE) (Rys. 2A) są prawie symetryczne w stosunku do TS2. Bariery pierwszego i trzeciego etapu są podobne. Drugi etap, o niewielkiej barierze (≈1 kcal/mol), nie może być decydujący dla szybkości reakcji, ponieważ polega jedynie na niewielkim przesunięciu atomu H poprzez minimalną rotację (zaledwie o kilka stopni, ponieważ Asp-40 jest silnie nachylony względem płaszczyzny substratu) wokół wiązania C-C (lub C-H na Rys. 1 i 3). Reakcję można więc praktycznie uznać za dwuetapową. Reszty katalizują pierwszy etap poprzez (częściowe) oddanie protonu do substratu (jako kwasu), natomiast trzeci etap katalizowany jest poprzez (częściowe) przyjęcie protonu od substratu (jako zasady). Odnosi się do odległości międzytlenkowych wiązań H oraz odległości poza centrum wspólnego protonu od punktu środkowego O3 i Or, gdzie wartość dodatnia/ujemna wskazuje, że proton znajduje się w pobliżu reszt/substratu.

Dla reszt kwaśnych o niższym powinowactwie do protonu (pA w fazie gazowej lub pKa w ośrodku dielektrycznym), bariera aktywacji byłaby niższa dla pierwszego etapu i wyższa dla trzeciego etapu, podczas gdy reszty zasadowe o wyższym pA lub pKa dawałyby efekt przeciwny. W związku z tym, w dwustopniowym mechanizmie enzymatycznym optymalną moc katalityczną uzyskuje się, gdy reszty enzymu pełnią podwójną rolę bardzo silnego donora/akceptora protonów do/z substratu na przemian (określane jako katalizator amfi-kwasowy/zasadowy lub bufor protonowo-elektronowy) dla całej reakcji. W dielektrycznym medium enzymów, maksymalny efekt katalityczny uzyskuje się w przypadku równych pK reszt i substratu. Sytuacja ta jest odwrotna do reakcji jednoetapowych, w których duża różnica pKa zwiększa reaktywność (47, 48). Warunek równych pKa pomiędzy resztami i substratem dla uzyskania maksymalnego efektu katalitycznego pokrywa się z wymogiem posiadania przez reszty w enzymie równoważnych pKa z substratem w celu utworzenia maksymalnych SSHB (4-7, 15, 23, 24). Tak więc, w dwuetapowym mechanizmie reakcji KSI, SSHBs jako katalizatory amfi-kwasowe/zasadowe wraz z częściowymi przemieszczaniem protonów i redystrybucją ładunków odgrywają kluczową rolę w silnej stabilizacji EIs o ≈15 kcal/mol w energii stabilizacji zależnej od reszt oraz w zależnym od ścieżki reakcji skróceniu odległości międzytlenkowych w stosunku do stanu ES.

Energia stabilizacji sterowanej resztami ΔΔEa jest w pewnym stopniu skorelowana z ΔdES, chyba że następuje przeniesienie protonu z reszty na substrat (tzn, chyba, że ΔrH znajduje się w regionie ujemnym (Rys. 2C). Dlatego też, stabilizacja w EIs i TSs może być skorelowana ze skróceniem odległości wiązania H, a więc i siły wiązania H, w stosunku do stanu ES. Oznacza to, że normalne (lub zwykłe) wiązania H (pomiędzy neutralnymi partnerami) w ES mają tendencję do przekształcania się w SSHB (z udziałem jonów) w EIs i TS2. Tak więc, te krótkie wiązania powinny być odpowiedzialne za część napędzanego przez reszty obniżenia energii. Podobnie jak w przypadku transferu protonu, potencjał przy ES jest pojedynczą studnią dla wszystkich mutantów, podczas gdy kształt potencjału (w pobliżu EIs lub TSs) w regionie, gdzie ΔrH jest bliski zeru (tj. wokół TS1/EI1 dla c i EI1/TS2 dla e i f na Rys. 2C) nosi pewne cechy studni podwójnej. Dla małej bezwzględnej wartości ΔrH (<≈0.5 Å) (Rys. 2C), bariera dla przeniesienia protonu jest w naszych obliczeniach bardzo mała, a więc samo przeniesienie protonu w potencjale typu podwójnej studni nie może tłumaczyć drastycznego obniżenia bariery aktywacji. Istotnie, przypadek g, w którym właściwości potencjału typu podwójnej gwiazdy prawie zanikają przy niewielkim transferze protonu, wykazuje większe obniżenie energii niż przypadek f, w którym dochodzi do transferu protonu w potencjale typu podwójnej gwiazdy. Z drugiej strony, na Rys. 2 D i E należy zauważyć, że po transferze protonów ΔdES nie ulega już skróceniu, lecz nieznacznemu wydłużeniu, natomiast ΔΔEa ulega dalszemu obniżeniu. Zatem, samo skrócenie długości wiązań H (tj. ΔdES) nie tłumaczy drastycznego obniżenia bariery na TSs i EIs (tj. ΔΔEa). Tak więc, obniżenie bariery przy TSs i EIs musi być wyjaśnione przez dodatkowe siły oddziaływania, które będą omówione w kategoriach oddziaływań orbitali molekularnych (MO) pomiędzy substratami i resztami (obejmujących indukowane przeniesieniem ładunku rearanżacje elektronowe lub redystrybucje ładunku).

W przypadku dwóch konkurujących reszt, jak w f i g, kumulatywna stabilizacja EIs/TSs skutkuje bardziej wzmocnionym kcat. Jednakże, efekt ten jest nieco subaddytywny (tj. mniejszy niż suma energii stabilizacji każdej reszty) w wyniku zmniejszonej mocy pochłaniania protonów przez oksyanion dla każdej reszty z powodu obecności drugiej reszty. Ta subaddytywno¶ć wskazuje, że SSHBs obejmuj± przeniesienie ładunku i polaryzację (tj. indukowane oddziaływania elektrostatyczne) i być może czę¶ciowe wi±zanie kowalencyjne. Istotnie, stabilizacja EI i TS w obecności reszt katalitycznych wynika głównie z delokalizacji nadmiaru elektronów obecnych w miejscu aktywnym poprzez przeniesienie ładunku i polaryzację, co zostanie pokazane poniżej. Efektywne ładunki populacji naturalnych orbitali wiązań (49) substratu w przypadkach a, c-e, i f w TS1 wynoszą odpowiednio -0.57, ≈-0.43, i -0.37. Zatem ujemny ładunek substratu jest bardziej zredukowany w obecności dwóch reszt katalitycznych. Redukcja ta wynika z przeniesienia nadmiaru elektronu z substratu na reszty katalityczne o dużym powinowactwie elektronowym, które pełnią rolę bufora dla nadmiaru elektronu. Asp ma wprawdzie silniejszą zdolność do oddawania elektronów niż Tyr, ale Tyr ma niższe powinowactwo elektronowe niż Asp. Tak więc, Tyr jest tak samo lub nieco bardziej efektywny w obniżaniu bariery aktywacji niż Asp. Stabilizacja TSs i EIs w obecno¶ci reszt katalitycznych jest silnie skorelowana z obniżeniem energii stanu nadmiaru elektronów, ponieważ przestrzeń do pomieszczenia nadmiaru elektronów jest powiększona o reszty katalityczne obok substratu. To obniżenie energii jest bezpośrednio związane z zasadą nieoznaczoności; im mniej zlokalizowany jest nadmiar elektronu, tym bardziej jest on ustabilizowany.

Obliczone przesunięcia chemiczne (δ) są nieco skorelowane z najmniejszą wartością d(O3-Or) dla tej samej liczby wiązań H, podczas gdy obecność drugiego wiązania H zwiększa δ z powodu zwiększonego efektu ekranowania. Na podstawie naszych wyników można stwierdzić, że duża wartość δ może być często dobrym wskaźnikiem SSHB, ale δ jest tylko częściowo skorelowana z kcat. Korelacja ta szczególnie słabnie dla dużych wartości δ (>16 ppm) lub małych wartości bezwzględnych ΔrH (<0,5 Å), ponieważ zależność kcat od δ została zakwestionowana (50).

Obniżenie barier aktywacji w obecności reszt katalitycznych jest dobrze poznane na podstawie analizy MO (Rys. 3). Uderzająca różnica w poziomach energetycznych TS2 MO pomiędzy a i g wynika z kwantowej natury nadmiaru gęstości elektronowej zgromadzonej na substracie w wyniku deprotonacji przez Asp-40. Stabilizacja uzyskana przez odprowadzenie części gęstości elektronowej do reszt katalitycznych wynika ze wspomnianej wcześniej zasady nieoznaczoności, która jest podobna do tej obserwowanej w przypadku nadmiaru elektronu oddziałującego z klastrami wody (51, 52), co przemawia za dość dużą przestrzenią wnęki. Tak więc obecność reszt katalitycznych (które pełnią rolę buforującą ładunek poprzez częściowe przeniesienie elektronu z substratu na reszty katalityczne) drastycznie zmniejsza gromadzenie się ładunku na oksyanionie. Ta stabilizacja EIs i TSs jest zasadniczo wspomagana przez SSHBs. Efekt ten jest silnie wzmocniony w obecności zarówno Asp-103 jak i Tyr-16/57. Energia MO w przypadku g jest więc znacznie niższa niż w przypadku a. Efekt nośnika dielektrycznego enzymu nie jest tak drastyczny jak efekt reszt katalitycznych polegający na przeniesieniu elektronu. Zatem częściowe przemieszczenia protonów i redystrybucje ładunku promowane przez SSHBs są bardziej odpowiedzialne za obniżenie TSs i EIs niż efekt dielektryczny enzymu. W konsekwencji, efekt katalityczny wynika z korzystnej kombinacji zysków z nieindukowanych energii elektrostatycznych i energii oddziaływań MO (polaryzacja, przeniesienie ładunku i energia wiązania kowalencyjnego). Podczas gdy pierwsza z nich wynika z częściowych migawek protonowych spowodowanych obecnością naładowanych wiązań H (a więc związanych z siłą SSHBs), druga wynika głównie z delokalizacji elektronów dzięki resztom katalitycznym, które pełnią rolę bufora dla nadmiaru elektronu. Przyrost energii interakcji MO jest ściśle związany z dodatkową interakcją enzym-substrat promowaną przez SSHB.

Energia stabilizacji może być zatem reprezentowana jako suma zwiększonej energii naładowanego wiązania H (obejmującego gatunki jonowe) EIs/TSs w stosunku do normalnego wiązania H (pomiędzy neutralnymi partnerami) ES i przyrostu energii interakcji MO z powodu redystrybucji ładunku obejmującego rozpraszanie elektronów do reszt katalitycznych. Ponieważ te dwa terminy energetyczne nie są łatwo rozłączne, trudno jest oszacować każdy z nich. Jednakże, w przypadku d oszacowaliśmy te terminy za pomocą następującej metody. Z porównania energii EI1 względem ES w nieobecności i obecności Tyr-16 (Y16) wynika, że energia stabilizacji EI1 przez Y16 wynosi 8.7 kcal/mol. W celu zbadania udziału nieindukowanego oddziaływania elektrostatycznego (które nie obejmuje efektu indukcji elektrostatycznej substratu + Asp-40 (D40) na resztę Y16) w stabilizacji, przeprowadziliśmy obliczenia ES i EI1 w przypadku, gdy Y16 jest zastąpiona resztą widmową, składającą się jedynie z jej ładunków w naturalnym orbitalu wiązania (NBO) (Y16q), które zostały obliczone dla pojedynczej cząsteczki Y16 w nieobecności substratu + D40. Następnie, przyrost energii nieindukowanej interakcji elektrostatycznej (lub przyrost energii elektrostatycznej napędzanej przez preorganizację) wynosi 4.4 kcal/mol, co odpowiada za zwiększoną siłę wiązania naładowanego wiązania H (czyli samego SSHB). Następnie, różnica w energiach stabilizacji pomiędzy pełnym efektem kwantowym Y16 a nieindukowanym efektem elektrostatycznym Y16q (4.3 kcal/mol) powinna pochodzić z energii indukowanej interakcji elektrostatycznej, energii kowalencyjnej, itd. Indukowane oddziaływanie elektrostatyczne obejmuje efekty polaryzacji i przeniesienia ładunku. Aby uzyskać przyrost indukowanej energii elektrostatycznej, najpierw uzyskaliśmy ładunki atomowe Y16 (Y16qind), które obejmują efekt indukcji w obecności substratu + D40. Następnie przeprowadziliśmy obliczenia ES i EI1 w przypadku, gdy Y16 jest zastąpiony przez resztę widmową (Y16qind) składającą się wyłącznie z jego punktowych ładunków atomowych. Ponieważ energia stabilizacji wynosi 8.2 kcal/mol, indukowany zysk energii elektrostatycznej z oddziaływania pomiędzy substratem + D40 i Y16 wynosi 3.8 kcal/mol. Tak więc przyrost energii w wyniku przeniesienia ładunku i polaryzacji jest duży i porównywalny z nieindukowanym przyrostem energii elektrostatycznej. Reszta Y16 odgrywa ważną rolę katalitycznego bufora ładunku, który wycofuje i utrzymuje dużą część nadmiaru ładunku ujemnego w substracie, jak również odpowiednią redystrybucję ładunku elektronowego podczas reakcji. Ta indukowana energia elektrostatyczna powstaje z energii interakcji MO poprzez kwantowo-mechaniczne oddziaływanie ładunku elektronowego pomiędzy reszt± katalityczn± (Y16) a substratem + D40 (tj. energia interakcji substrat-residue napędzana przez SSHB). Wreszcie, pozostały wkład energetyczny w wysokości 0,5 (= 8,7 – 8,2) kcal/mol może odpowiadać głównie nieelektrostatycznej energii kowalencyjnej. Energia ta jest raczej niewielka, co jest dodatkowo potwierdzone przez naszą analizę MO, że nieelektrostatyczne nakładanie się orbitali w samym SSHB nie jest znaczące.

W enzymach obejmujących dwuetapowy mechanizm reakcji, substrat nie jest w pełni ujemnie naładowany, ale jest częściowo anionowy z rozpraszaniem elektronów do reszt katalitycznych. Zatem w tym przypadku przyrost energii stabilizacji (≈10 kcal/mol przy EI1) napędzany przez SSHB w stosunku do normalnego wiązania H okazuje się nie być mały. Jeżeli energia SSHB zostanie rozszerzona o oddziaływania substrat-reszta, wynikające z redystrybucji ładunku zarówno w substracie jak i reszcie, to energia stabilizacji jest sumą energii SSHB napędzanej preorganizacją i energii oddziaływań MO napędzanej SSHB. Jeśli jednak weźmiemy pod uwagę tylko siłę samego SSHB, to przyrost energii wiązania jest znacznie mniejszy (do ≈5 kcal/mol).