Type I isozyme

As evident from Fig. 1,hexokinase serves as the gateway through which Glc enters alternativemetabolic pathways. Niemniej jednak, prawdopodobnie bezpiecznie jest powiedzieć, że heksokinaza jest najczęściej uważana za enzym glikolityczny, a metabolizm glikolityczny jest ogólnie uważany za proces cytoplazmatyczny. To było zatem niezwykłe, że w przeciwieństwie do innych enzymów glikolitycznych, aktywność heksokinazy (obecnie znany jako izozym Typu I) został znaleziony głównie w `frakcji cząstek stałych’ z mózguhomogenates (Crane i Sols, 1953). Późniejsze prace (Johnson, 1960;Rose i Warms, 1967; patrz także Wilson, 1995) wykazały, że cząsteczkowa heksokinaza była związana z mitochondriami, a dokładniej z zewnętrzną błoną mitochondrialną (Rose i Warms, 1967;Kropp i Wilson, 1970).Wiązanie jest krytycznie zależne od hydrofobowej sekwencji N-końcowej (Polakis i Wilson, 1985), która selektywnie kieruje izozym Typu I do mitochondriów (Gelb i in., 1992;Sui i Wilson, 1997) i jest wprowadzana do hydrofobowego rdzenia zewnętrznej błony mitochondrialnej w trakcie wiązania (Xie i Wilson, 1988). Porin (zwany także `VDAC, skrót od `voltagedependent anion channel’) tworzy kanał, przez który metabolity przemieszczają się przez zewnętrzną błonę mitochondrialną i został zidentyfikowany jako białko błony zewnętrznej mitochondrium, które oddziałuje z heksokinazą (Felgner i in., 1979; Lindén i in., 1982; Fiek i in., 1982). Co więcej, istnieją dowody na poparcie poglądu, że wiązanie heksokinazy zachodzi preferencyjnie z poriną, która znajduje się w miejscach kontaktowych, czyli regionach, w których dochodzi do bliskiego kontaktu pomiędzy wewnętrzną i zewnętrzną błoną mitochondrialną (Dorbani i in., 1987;Kottke i in., 1988;BeltrandelRio i Wilson,1992a).

Klasyczne badania Johnson(1960) i Rose i Warms(1967) były wkrótce poreports mitochondrialnie związanej heksokinazy z innych normalnych tkanek, oprócz mózgu, jak również z różnych komórek nowotworowych (dla odniesień, patrzWilson, 1985,1995). Potencjalne znaczenie fizjologiczne tego stowarzyszenia `glikolitycznego’ enzymu zmitochondriami, podstawowym miejscem metabolizmu oksydacyjnego, było przedmiotem wielu spekulacji. Od początku, a zwłaszcza po uznaniu, że „białko wiążące heksokinazę” zewnętrznej błony mitochondrialnej było identyczne z poriną, a zatem, że heksokinaza może być umieszczona w pobliżu punktu, w którym ATP opuszcza mitochondria (a ADP ponownie do nich wchodzi), spekulacje skupiały się głównie na możliwości, że ta bliskość może sprzyjać intymnej interakcji metabolicznej między wewnątrzmitochondrialną fosforylacją oksydacyjną jako źródłem substratu ATP i fosforylacją Glc przez mitochondrialnie związaną heksokinazę. To, faktycznie, został rozważony przez Rose i Warms (1967), ale nie może być poparte przez ich wyników eksperymentalnych. Jednakże, późniejsze prace innych (ponownie, dla odniesienia patrz Wilson,1985,1995), przy użyciu mitochondrialnie związaną heksokinazę z różnych źródeł, produkowane dowody na poparcie poglądu, że mitochondrialnie związana heksokinaza miał `preferencyjny’ lub ` uprzywilejowany’ dostęp do wewnątrzmitochondrialnie generowane ATP.

Praca w naszym laboratorium dostarczyła solidnych podstaw do poglądu, żeheksokinaza związana z aktywnie fosforyzującymi mitochondriami mózgu jest rzeczywiścietightly coupled do wewnątrzmitochondrialnego przedziału substratu ATP, generowanego przez fosforylację oksydacyjną. Eksperymentalne poparcie tego wniosku zostało opisane w szeregu publikacji (Beltrandel Rio i Wilson, 1991,1992a,b; de Cerqueira Cesar i Wilson, 1995,1998,2002; Hashimoto i Wilson, 2000). Kompletny przegląd tej pracy nie jest możliwy w ramach ograniczeń obecnego kontekstu, ale podkreślimy niektóre z głównych ustaleń, aby zilustrować różnorodność podejść eksperymentalnych, wszystkie prowadzące do tego samego wniosku, które zostały wykorzystane w tych badaniach.

Wstępne badania (BeltrandelRio i Wilson,1991,1992a,b) zostały wykonane przy użyciu metod spektrofotometrycznych, w których produkcja ATP przez różne procesy śródmitochondrialne (fosforylacja oksydacyjna, reakcja kinazy adenylanowej, reakcja kinazy kreatynowej) i fosforylacja Glc przez heksokinazę były powiązane z produkcją NADPH, monitorowaną przy długości fali 340 nm, przez zastosowanie odpowiednich enzymów sprzęgających. Podstawową ideą było to, że porównując tempo fosforylacji Glc z tempem produkcji ATP z różnych źródeł, można wywnioskować względne znaczenie różnych wewnątrzmitochondrialnych procesów generujących ATP jako źródło substratu ATP dla heksokinazy. A wniosek był taki, że kiedy fosforylacja oksydacyjna zachodziła, ani kinaza adenylanowa, ani kinaza kreatynowa nie były znaczącym źródłem substratu ATP. Co więcej, tylko część ATP wytwarzanego w procesie fosforylacji oksydacyjnej była wykorzystywana przez heksokinazę, co powodowało, że w środowisku pozamitochondrialnym tempo fosforylacji oksydacyjnej nadal rosło. Szybkość fosforylacji Glc nie wzrastała stale w odpowiedzi na ciągły wzrost ekstramitochondrialnego ATP, jednakże, pomimo faktu, że ten ostatni był porównywalny do Km dla ATP widzianego z dodanym ekstramitochondrialnym ATP przy braku fosforylacji oksydacyjnej, tj. heksokinaza nie byłaby „nasycona” ekstramitochondrialnym ATP jako substratem (Rys.2). To silnie sugeruje, że to nie był pozamitochondrialny ATPthat był używany jako substrat.

Dalsze wsparcie dla tego zostało dostarczone przez wyniki takie jak te pokazane na Rys. 3. Tutaj, fosforylacja Glc była monitorowana po zainicjowaniu fosforylacji oksydacyjnej przez dodanie ADP, z rosnącymi stężeniami pozamitochondrialnego ATP obecnego od początku. Zgodnie z oczekiwaniami klasycznej Michaelisa-Mentenkinetyki, początkowa szybkość fosforylacji Glc wzrastała wraz z rosnącym stężeniem pozamitochondrialnego ATP. Jednakże, z czasem osiągnięto stan ustalony tempa fosforylacji Glc, który był niezależny od ilości obecnego ATP. Wyniki te zostały zinterpretowane jako wskazujące, że podczas gdy mitochondrialnie związana heksokinaza początkowo używała ATP pozamitochondrialnego, inicjacja fosforylacji oksydacyjnej doprowadziła do zmiany preferencji substratu, z heksokinazą stającą się zależną od wewnątrzmitochondrialnego przedziału ATP, który był określony przez tempo fosforylacji oksydacyjnej i niezależny od pozamitochondrialnego.

Although ATP production began almost immediately after initiation ofoxidative phosphorylation by addition of ADP, there was a marked lag ininitiation of Glc phosphorylation by the mitochondrially bound hexokinase(Fig. 3D) before attainment ofa steady state rate that persisted for an extended period. Ten początkowy okres opóźnienia został zinterpretowany jako czas wymagany do wypełnienia wewnątrzmitochondrialnego przedziału ATP generowanym przez fosforylację oksydacyjną, z którego mitochondrialnie związana heksokinaza pobierała swój substrat ATP. Zahamowanie transportu elektronów przez dodanie KCN spowodowało pozorne uwolnienie ATP, przypuszczalnie z przedziału śródmitochondrialnego, a właściwości tego „przedziału” (kinetyka wypełniania, powiązanie z wewnątrzmitochondrialną produkcją ATP, itd.) były w satysfakcjonującej zgodności z oczekiwaniami opartymi na tej interpretacji (BeltrandelRio i Wilson,1991,1992a,b).Niestety, zgodność z oczekiwaniami nie jest nieomylnym przewodnikiem do prawdziwych faktów, a `widoczne uwolnienie ATP’ zostało następnie uznane za artefakt (Laterveer et al.,1993), którego źródło jest nadal niezrozumiałe i który nie mógł być odtworzony w późniejszej pracy (deCerqueira Cesar i Wilson, 1998). Pomimo tego zniechęcającego i żenującego niepowodzenia, podstawowa koncepcja sprzężenia mitochondrialnie związanej heksokinazy z wewnątrzmitochondrialnym przedziałem ATP została poparta innymi dowodami i wytrzymała kolejne testy doświadczalne.

Metoda podwójnego znakowania izotopowego została opracowana jako alternatywa dla procedur spektrofotometrycznych (deCerqueira Cesar i Wilson, 1995). Glc znakowany 14C był używany jako substrat dla heksokinazy, a 32Pi dostarczał substratu do syntezy ATP poprzez fosforylację oksydacyjną. Stosunek32P/14C w Glc-6-P stanowił zatem miarę specyficznej aktywności substratu ATP wykorzystywanego przez heksokinazę. Stosunek32P/14C Glc-6-P wytwarzanego przez związaną z mitochondrium heksokinazę został porównany z tym wytwarzanym przez heksokinazę drożdżową, która nie wiąże się z mitochondriami i dlatego z konieczności wykorzystuje pozamitochondrialnyATP jako substrat. Kinetyka znakowania pul ATP używanych jako substrat przez heksokinazę związaną z mitochondrium i heksokinazę drożdżową była uderzająco różna, ponownie zgodna z poglądem, że heksokinaza związana z mitochondrium nie wykorzystywała pozamitochondrialnego ATP jako substratu, ale raczej czerpała z wewnątrzmitochondrialnego przedziału ATP dostarczanego przez fosforylację oksydacyjną.Na przykład (Rys. 4), dodanie nadmiaru 31Pi, a tym samym wyraźne zmniejszenie specyficznej aktywności 32P-ATP syntetyzowanego przez fosforylację oksydacyjną, spowodowało szybki spadek stosunku 32P/14C Glc-6-P wytwarzanego przez heksokinazę drożdżową, wykorzystującą pozamitochondrialny ATP. W przeciwieństwie do tego, nastąpił opóźniony, a następnie nieco wolniejszy spadek stosunku32P/14C Glc-6-P produkowanego przez mitochondrialnie związaną heksokinazę. Te ostatnie obserwacje ponownie były zgodne z poglądem, że mitochondrialna heksokinaza wykorzystywała wewnątrzmitochondrialny przedział ATP, który nie był swobodnie zrównany z pozamitochondrialnymATP.

Jeszcze inne podejście eksperymentalne opierało się na porównaniu mitochondrialnie związanej heksokinazy i niezwiązanego enzymu drożdżowego (de Cerqueira Cesar i Wilson, 1998,2002). Podstawowa logika jest zilustrowana na Rys. 5. Stała ilość mitochondriów mózgu ze związaną heksokinazą mieszana jest ze wzrastającymi ilościami mitochondriów wątroby szczura, które nie zawierają związanej heksokinazy. Zarówno mitochondria mózgowe jak i wątrobowe aktywnie fosforylują i w ten sposób w miarę zwiększania ilości mitochondriów wątrobowych wzrasta tempo wytwarzania ATP w systemie. Z założenia, stężenie pozamitochondrialnegoATP jest utrzymywane w stanie nasycenia, tj. ÅKm heksokinazy z pozamitochondrialnym ATP jako substratem (przy braku fosforylacji oksydacyjnej). Jeżeli mitochondrialnie związana heksokinaza używa pozamitochondrialnego ATP jako substratu, oczekuje się stopniowego wzrostu szybkości fosforylacji Glc, ponieważ szybkość produkcji ATP jest zwiększona przez dodanie wzrastających ilości mitochondriów wątroby. W rzeczywistości, to nie jest to, co jest obserwowane; raczej, szybkość fosforylacji Glc przez heksokinazę związaną z mitochondrium nie ma znaczącego wpływu na wzrost szybkości produkcji ATP (Rys.6). W przeciwieństwie do tego, oczekiwany wzrost szybkości fosforylacji Glc jest widoczny, jeśli mitochondrialna heksokinaza jest zastąpiona przez równoważną ilość heksokinazy drożdżowej. Wyniki te są więc ponownie zgodne z poglądem, że mitochondrialnie związana heksokinaza wykorzystuje wewnątrzmitochondrialny ATP, nieodłączny od mitochondriów, z którymi heksokinaza jest związana, ale niezależny od jakiegokolwiek wzrostu wewnątrzmitochondrialnego ATP pochodzącego z wolnych od heksokinazy livermitochondriów.

Wreszcie, dalsze dowody na pogląd, że mitochondrialnie związana heksokinaza może rozróżniać między wewnątrz- i pozamitochondrialnym ATP pochodzi z badania inhibicji przez analog Glc-6-P, 1,5-anhydroglucitol-6-P(1,5-AnG6P). W nieobecności fosforylacji oksydacyjnej i przy sześciomitochondrialnym ATP jako substracie, 1,5-AnG6P jest dość silnym inhibitorem, konkurencyjnym w stosunku do ATP (Rys.7) (Hashimoto i Wilson, 2000). W przeciwieństwie do tego, z ATP dostarczanym przez fosforylację oksydacyjną, 1,5-AnG6P jest znacznie mniej skutecznym inhibitorem. Wyraźnie widać, że ATP dostarczany przez fosforylację oksydacyjną nie jest równoważny z ATP pozamitochondrialnym. Podobne wyniki zostały ostatnio przedstawione przy użyciu heksokinazy mitochondrialnej z mózgu wołowego(de Cerqueira i Wilson,2002).

W skrócie, obecny pogląd jest taki, że przy braku fosforylacji oksydacyjnej, mitochondrialna heksokinaza może łatwo wykorzystać pozamitochondrialnyATP, zgodnie z klasyczną kinetyką Michaelisa-Mentena. Jednak podczas aktywnej fosforylacji oksydacyjnej enzym związany z mitochondrium jest sprzężony z wewnątrzmitochondrialną pulą ATP, a tempo fosforylacji glokinazowej jest ściśle skorelowane z tempem fosforylacji oksydacyjnej. Trudno uwierzyć, że w normalnej tkance mitochondria znajdują się kiedykolwiek w stanie całkowicie pozbawionym fosforylacji. Zmiany w tempie? Tak, oczywiście, w zależności od wahań w zapotrzebowaniu na energię. Ale czy naprawdę niefosforylujące? Prawdopodobnie tylko w najbardziej tragicznych – i ostatecznie śmiertelnych – okolicznościach. Wynika z tego, że w normalnych warunkach tempo fosforylacji Glc jest ściśle skoordynowane z końcowymi oksydacyjnymi etapami metabolizmu Glcm zachodzącymi w mitochondriach, z towarzyszącą im produkcją ATP przez fosforylację oksydacyjną. Jak wcześniej zauważono (BeltrandelRio i Wilson,1992a), taka koordynacja może zapewnić wprowadzenie Glc do metabolizmu glikolitycznego w tempie współmiernym do końcowych etapów oksydacyjnych, unikając produkcji neurotoksycznego mleczanu (Marie i Bralet, 1991), jednocześnie zapewniając przepływ netto przez cytoplazmatyczne i mitochondrialne części szlaku w tempie odpowiednim do zaspokojenia potrzeb energetycznych (Rys. 8).

Nie wiadomo, jak ta niezwykła zmiana w specyficzności substratu (wewnątrz mitochondrialny versus pozamitochondrialny ATP) jest wywoływana przez fosforylację oksydacyjną, ale jasne jest, że na konformację związanego z mitochondrium enzymu wpływa potencjał błony mitochondrialnej, jak również inne czynniki związane z funkcją mitochondriów, Wskazuje to na ścisłą interakcję pomiędzy wewnętrzną (w poprzek której istnieje potencjał błonowy) i zewnętrzną (do której związana jest heksokinaza) błoną tego organelle (Hashimoto i Wilson, 2000).Zmiany konformacyjne dotyczące regionów cząsteczki zaangażowanych w wiązanie substratu ATP były wcześniej postulowane (de Cerquiera i Wilson,1998) jako odpowiedzialne za zmiany w specyficzności substratowej.