2.2. Test Amesa

Test Amesa został wykorzystany do zbadania mutagenności Copaifera spp. Metodologia preinkubacji opracowana przez Marona i Amesa, z i bez egzogennej aktywacji (S9), została zastosowana do analizy różnych szczepów Salmonella Typhimurium (TA98, TA100, TA97a, i TA102) w celu zidentyfikowania czynników, które powodują mutacje genów. Szczepy testerów, uprzejmie dostarczone przez Dr. B.N. Ames (Berkeley, CA, USA), były hodowane z zamrożonych kultur przez 12-14 godzin, przez noc, w Oxoid Nutrient Broth Number 2.

Do oznaczenia aktywności mutagennej, różne stężenia każdej oleożywicy, każdego ekstraktu lub kwasu kaurenowego rozpuszczonego w DMSO dodano do 0,1 mL hodowli bakteryjnej w 0,5 mL buforu fosforanowego 0,2 M lub 0,5 mL mieszaniny 4% S9 i inkubowano w 37°C przez 20-30 min. Stężenia wynosiły od 62,5 do 500 μg/płytkę dla C. lucens (ekstrakt), od 120 do 1000 μg/płytkę dla C. multijuga (ekstrakt), od 125 do 1000 μg/płytkę dla C. oblongifolia (oleożywica), od 500 do 4000 μg/płytkę dla C. langsdorffii (oleożywica) i od 25 do 200 μg/płytkę dla kwasu kaurenowego. Stężenia te zostały wybrane na podstawie wstępnego badania toksyczności. We wszystkich kolejnych badaniach górną granicę badanego zakresu dawek stanowiła albo najwyższa nietoksyczna dawka, albo najniższa toksyczna dawka ustalona w badaniu wstępnym. Toksyczność została wykryta albo jako zmniejszenie liczby rewersantów histydynowych (His+) albo jako przerzedzenie auksotroficznego trawnika tła.

Mieszanina aktywacji metabolicznej (frakcja S9) przygotowana z wątroby szczurów Sprague Dawley poddanych działaniu mieszaniny polichlorowanych bifenyli Aroclor 1254 (500 mg/kg) została zakupiona od Molecular Toxicology Inc. (Boone, NC, USA) i świeżo przygotowywane przed każdym testem. System aktywacji metabolicznej składał się z 4% frakcji S9, 1% chlorku magnezu 0,4 M, 1% chlorku potasu 1,65 M, 0,5% disodowego D-glukozo-6-fosforanu 1 M i 4% soli sodowej fosforanu dinukleotydu nikotynamido-adeninowego (NADP) 0.1 M w 50% buforu fosforanowego 0,2 M i 39,5% sterylnej wody destylowanej.

Po inkubacji dodano 2 mL top agaru, a mieszaninę wylano na płytkę zawierającą minimalny agar. Płytki inkubowano w temperaturze 37°C przez 48 h, a kolonie His+ revertant liczono ręcznie.

Wyniki analizowano za pomocą pakietu oprogramowania statystycznego Salanal 1.0 (U.S. Environmental Protection Agency, Monitoring Systems Laboratory, Las Vegas, NV, z Research Triangle Institute, RTP, NC, USA); przyjęto model Bernsteina i wsp. Dane (revertanty/płytkę) oceniono za pomocą analizy wariancji (ANOVA), a następnie regresji liniowej. Indeks mutagenny (MI) został również obliczony w odniesieniu do każdego badanego stężenia i odpowiadał średniej liczbie revertantów na płytce badanej podzielonej przez średnią liczbę revertantów na płytce kontrolnej rozpuszczalnika. Próbka została uznana za mutagenną, gdy wykryto zależność dawka-odpowiedź oraz MI był wyższy niż dwa (MI > 2) przy jednym lub większej liczbie stężeń .

Następujące standardowe mutageny zostały wykorzystane jako kontrole pozytywne w doświadczeniach bez mieszaniny S9: 4-nitro-O-fenylenodiamina (10 μg/płytkę) dla TA98 i TA97a, azydek sodu (1,25 μg/płytkę) dla TA100 oraz mitomycyna C (0,5 μg/płytkę) dla TA102. W eksperymentach z aktywacją S9, 2-antramina (1,25 μg/płytkę) była stosowana jako kontrola pozytywna dla TA98, TA97a i TA100, a 2-aminofluorena (10 μg/płytkę) była stosowana jako kontrola pozytywna dla TA102. DMSO służył jako kontrola rozpuszczalnika (100 μL/płytkę) i kontrola negatywna odpowiada szybkości spontanicznej rewersji każdego szczepu.

3. Wyniki

Tabela 2 pokazuje średnią liczbę revertantów/płytkę (M), odchylenie standardowe (SD), oraz indeks mutagenny (MI) obserwowany dla S. Typhimurium szczepów TA98, TA100, TA102, i TA97a w obecności (+S9) lub w nieobecności (-S9) aktywacji metabolicznej po poddaniu próbki działaniu docelowej oleożywicy, ekstraktu lub związku.

Ani ekstrakty z liści C. lucens i C. multijuga, ani oleożywice C. langsdorffii i C. oblongifolia nie powodowały mutacji genetycznych, jak wykazano w teście Amesa. Kwas kaurenowy nie zwiększył również liczby kolonii rewersyjnych, a więc nie wywierał działania mutagennego w żadnym z badanych stężeń ani na żadnym z ocenianych szczepów. Kontrola rozpuszczalnika (DMSO) nie różniła się znacząco pod względem liczby revertantów od kontroli negatywnej.

4. Dyskusja

Wpływy mutagenne wywierane przez rośliny nie są łatwo zauważalne u ludzi, a niekorzystne długoterminowe wyniki, takie jak rak, mogą się ujawnić. W związku z tym w literaturze naukowej podkreśla się znaczenie badań przesiewowych roślin leczniczych pod kątem ich potencjału mutagennego. W tym sensie, tutaj zbadaliśmy Copaifera spp. i potencjał mutagenny kwasu kaurenowego za pomocą testu Amesa. Akyıl i Konuk podkreślili, że wykrywanie czynników genotoksycznych często opiera się na wykorzystaniu bakterii jako organizmów testowych. W ten sposób, test Amesa (lub Salmonella / test mikrosomów) jest metodą, która jest najczęściej używana do wykrywania skutków mutagennych czynnika genotoksycznego .

Wykonanie testu Amesa przy użyciu różnych szczepów jest bardzo ważne, biorąc pod uwagę osobliwości każdego z nich w odniesieniu do testu. W ten sposób, marker hisG46 w szczepie TA100 wynika z zastąpienia leucyny (GAG/CTC) przez prolinę (GGG/CCC). Mutacja ta jest odwracana do stanu dzikiego przez mutageny, które powodują mutacje substytucji par zasad, głównie w jednej z par GC. Mutacja hisD3052 przenoszona przez szczep TA98 jest mutacją typu -1 frameshift, która wpływa na ramkę odczytu pobliskiej powtarzającej się sekwencji -C-G-C-G-C-G-C-G-. Odwrócenie mutacji hisD3052 z powrotem do stanu dzikiego jest indukowane przez różne mutageny typu frameshift, takie jak 2-nitrofluoren oraz różne aromatyczne nitrozowe pochodne aminowych czynników rakotwórczych. Mutacja hisD6610 w szczepie TA97a niesie również mutację przesunięcia ramki +1 (cytozyna) skutkującą biegiem 6 cytozyny (-C-C-C-C-C-). Uważa się, że ten szczep jest bardziej wrażliwy na niektóre z mutagenów, które odwracają szczep TA98. Opracowano szczep TA102, który zawiera pary zasad AT w miejscu mutacji hisG428. Mutacja ta jest przenoszona na plazmidzie wielokopijnym pAQ1. Plazmid ten nadaje oporność na tetracyklinę, co jest wygodnym markerem do wykrywania obecności plazmidu. Mutacja hisG428 jest mutacją ochrową, TAA, w genie hisG, która może być odwracana przez wszystkie sześć możliwych zmian par zasad; zarówno transwersje jak i transwersje. Ta mutacja jest również odwracana przez mutageny, które powodują uszkodzenia oksydacyjne, oprócz wykrywania środków sieciujących .

W dodatku, biologicznie aktywna substancja chemiczna może być biotransformowana do nieaktywnego metabolitu. Podobnie, nieaktywna substancja chemiczna może być biotransformowana do aktywnego metabolitu. Dlatego ważne jest, aby używać frakcji S9 w teście Amesa: pozwala to na przeprowadzanie analiz w obecności metabolizmu, zapewniając w ten sposób bardziej wiarygodne wyniki.

Tutaj, w odniesieniu do bezpieczeństwa, w naszych ustaleniach ani kwas kaurenowy, ani badane rośliny (ekstrakty i oleożywice) nie wywierały efektów mutagennych w różnych szczepach Salmonella Typhimurium, niezależnie od aktywacji S9.

Większość prac na temat rodzaju Copaifera dotyczy oleożywic usuniętych z pnia drzewa. Jednak badanie ekstraktów z liści jest również istotne, ponieważ zawierają one obiecujące bioaktywne cząsteczki. Rzeczywiście, poszukiwanie sposobów leczenia chorób poprzez napar z liści mogło być jednym z pierwszych sposobów wykorzystania produktów naturalnych, praktyka, która jest nadal przyjęta w dzisiejszych czasach .

Many Copaifera spp. są popularnie stosowane jako rośliny lecznicze w różnych krajach, ponieważ gatunki te prezentują liczne właściwości farmakologiczne. Tak jak w przypadku kwasu kaurenowego, kilka efektów biologicznych również zostało zgłoszonych .

Nasze badania są pierwszymi, które badają bezpieczeństwo gatunków C. lucens i C. oblongifolia, a także zatrudniają C. langsdorffii w oleożywicy do badania mutagenności. Wpływ C. multijuga (oleożywica/ekstrakt) na DNA był przedmiotem wcześniejszych badań, jednak z zastosowaniem innych technik niż w naszych badaniach, w których wykorzystano test Amesa. Tak więc, nasze wyniki potwierdzają dane opublikowane przez innych autorów, którzy testowali inne gatunki Copaifera i ich składniki chemiczne lub używali innych modeli eksperymentalnych i wykazali, że nie uszkadzają one DNA.

W ten sposób, oleożywica C. multijuga i jego marker chemiczny, diterpene kwasu kopalowego, zostały ocenione przez Alves et al. poprzez test mikrojądrowy (komórka V79) i test Amesa do badań in vitro, jak również mikrojądrowy i komety (myszy szwajcarskie) do badań in vivo. Uzyskane dane wykazały, że żaden z nich nie wywiera efektu genotoksycznego/mutagennego w zastosowanych warunkach eksperymentalnych. W porównaniu z naszymi wynikami, dane te wskazują, że dla C. multijuga zarówno ekstrakt, który został oceniony w naszym badaniu, jak i oleożywica, oceniona przez Alves et al. , nie mają wpływu na liczbę kolonii rewersyjnych w porównaniu z kontrolą negatywną w teście Amesa; to samo dotyczy kwasu kopalowego i kwasu kaurenowego. Wyniki te sugerują, że mutagenność jest nieobecna, niezależnie od aktywacji metabolicznej.

W ostatnim badaniu Furtado et al. ocenili potencjał genotoksyczny C. multijuga i wyniki wykazały brak uszkodzeń DNA, w związku z tym leczenie zarówno oleożywicą, jak i ekstraktem z liści C. multijuga nie zwiększa znacząco częstotliwości mikrojąder in vitro (komórki V79) i in vivo (myszy szwajcarskie). Ponadto autorzy oceniali również ekstrakty i oleożywice z innych gatunków tego rodzaju, takich jak C. duckei, C. reticulata, C. paupera i C. pubiflora i podobnie jak wyniki stwierdzone dla C. multijuga, brak genotoksyczności odnotowano dla wszystkich badanych gatunków.

Wyniki uzyskane w badaniach Alves et al. oraz Batista et al. wykazały, że ekstrakt C. langsdorffii nie zwiększył znacząco częstotliwości występowania mikrojąder (myszy szwajcarskie) odpowiednio we krwi obwodowej i szpiku kostnym. W innym badaniu, test kometowy z użyciem szczurów Wistar nie wykazał żadnych istotnych różnic pomiędzy zwierzętami leczonymi tylko ekstraktem C. langsdorffii a negatywną grupą kontrolną. Dane te wskazują, że ekstrakt nie wykazuje genotoksyczności.

Ostatnio, test mikrojądrowy in vivo i próba kometowa z użyciem szczurów Wistar wykazały, że ekstrakt Copaifera malmei nie jest genotoksyczny i ma aktywność antymutagenną. Co więcej, test toksyczności podprzewlekłej nie wykazał istotnych toksykologicznie zmian, jak sądzono z analiz behawioralnych, biochemicznych i hematologicznych przez okres do 30 dni. Wyniki te wskazują na wysoki margines bezpieczeństwa ekstraktu Copaifera malmei dla zastosowań terapeutycznych. Oznaczenia toksyczności i genotoksyczności wykazały, że stosowanie oleju Copaiba jest również bezpieczne: ocena histopatologiczna nie wykazała zmian u zwierząt leczonych olejem Copaiba, a ocena mutagenności (test mikrojądrowy; 2000 mg/kg m.c.) nie wykazała efektów genotoksycznych .

Leandro i wsp. zastosowali test Amesa, aby wykazać, że ekstrakt C. trapezifolia nie jest mutagenny wobec tych samych szczepów Salmonella Typhimurium badanych tutaj, niezależnie od aktywacji metabolicznej.

W odniesieniu do składu chemicznego różnych gatunków Copaifera, analizy UPLC-MS/MS i CG/MS oleożywic zidentyfikowały kwaśne diterpeny i główne lotne seskwiterpeny, podczas gdy wysoka zawartość związków fenolowych, w tym heterozydów flawonoidowych i pochodnych kwasu galoilochinowego została zweryfikowana w liściach . Wśród składników oleożywicy diterpeny są zdecydowanie głównymi składnikami i obejmują kwas ent-agathic, kwas ent-copalic i kwas ent-kaurenoic, a następnie seskwiterpeny, takie jak β-bisabolen, α-humulen i trans-β-kariofilen. W przypadku ekstraktów hydroalkoholowych z liści gatunku Copaifera, zawierają one głównie kwercetynę, afzelinę i kwasy chinowe .

Według Almeida et al. oleożywica Copaiba (produkt handlowy) i jej frakcje, które zawierają seskwiterpeny, estry metylowe diterpenowych kwasów karboksylowych i wysoki poziom β-kariofilenu, nie są genotoksyczne, jak wykazano w teście kometowym in vivo lub teście mikrojądrowym. β-kariofylen, główny składnik oleożywic i lotnych frakcji, nie promuje efektów cytotoksycznych lub genotoksycznych w hodowlach ludzkich limfocytów i chroni przed uszkodzeniami DNA wywołanymi przez metanosulfonian etylu. Ocena dziewięciu seskwiterpenów, w tym trans-kariofilenu, testem Amesa wykazała, że żaden z tych związków nie jest mutagenny.

W niedawnym badaniu, leczenie linii komórkowych raka żołądka i normalnej błony śluzowej żołądka kwasem kaurenowym wykazało, że stężenie kwasu silnie koreluje z indeksem uszkodzeń DNA i z częstotliwością mikrojąder, jak określono odpowiednio za pomocą testu kometowego i testu mikrojądrowego. Z drugiej strony, Cavalcanti i wsp. podali, że niskie stężenia kwasu kaurenowego, bioaktywnego diterpenoidu wyekstrahowanego z C. langsdorffii, również nie powodują uszkodzeń DNA ani nie zmieniają częstotliwości mikrojąder w komórkach V79. Znacząco zwiększone uszkodzenie DNA stało się widoczne dopiero po ekspozycji komórek na wyższe stężenia kwasu kaurenowego (30 lub 60 μg/mL).

Tutaj określiliśmy toksyczność kwasu kaurenowego dla każdego ocenianego szczepu Salmonella Typhimurium, stosując stężenia kwasu zaczynające się od granicy toksyczności. Wyższe stężenia kwasu kaurenowego uniemożliwiają wzrost bakterii, co umożliwiło nam ocenę potencjału mutagennego tego związku. Na podstawie naszych wyników, badane tu oleożywice nie są mutagenne nawet w najwyższych oznaczanych stężeniach.

Zgodnie z literaturą, wykorzystanie różnych organizmów lub zróżnicowanych systemów testowych może dostarczyć odmiennych wyników. Dzieje się tak dlatego, że systemy testowe genotoksyczności i mutagenności są podzielone na dwie grupy. Metody cytogenetyczne analizują eukariota i dają informacje, które różnią się od mutacji genów do uszkodzeń chromosomów i aneuploidii. W przeciwieństwie do metod bakteryjnych, metody bakteryjne analizują prokariota i dostarczają informacji o mutacji genowej oraz pierwotnych uszkodzeniach DNA spowodowanych przez czynnik .

Tak więc, badania takie jak wymiana chromatyd siostrzanych, aberracja chromosomalna oraz mikrojądro zostały zastosowane w celu wykrycia uszkodzenia DNA na poziomie chromosomalnym w biomonitoringu człowieka, podczas gdy badanie mutagenności Salmonella/mikrosomów Amesa zostało szeroko zastosowane w celu zweryfikowania aktywności mutagennej niezliczonych substancji chemicznych oraz surowych ekstraktów roślinnych.

Wcześniejsza praca zaobserwowała, że związki mogą być wyłącznie pozytywne w jednej lub więcej liniach komórkowych ssaków, to znaczy, że pozytywne wyniki nie były wspierające z testu Amesa lub badań in vivo . W rzeczywistości wyniki uzyskane najpierw w teście Amesa są następnie odtwarzane w testach z wykorzystaniem zwierząt; dlatego też brak mutagenności w teście Amesa umożliwił produkcję nowych leków o mniejszej liczbie skutków ubocznych. Dane te podkreślają znaczenie badań takich jak nasze, wykazujących brak mutagenności roślin i ich głównych składników, przy użyciu testu Amesa.

5. Wnioski

Ogółem, nasze wyniki przemawiają za bezpiecznym stosowaniem wybranych roślin leczniczych należących do rodzaju Copaifera. Niemniej jednak, mutagenne działanie pojedynczych związków może być maskowane przez antagonistyczne działanie innych związków obecnych w ekstraktach lub oleożywicach. Tak więc, nasze wyniki pokazują również, że zarówno kwas kaurenowy, jak i oceniane rośliny lecznicze mogą być uważane za potencjalnie bezpieczne do użytku terapeutycznego.

Dostępność danych

Dane użyte do poparcia wyników tego badania są zawarte w artykule.

Ujawnienie danych

Carlos Henrique Gomes Martins, Flávia Aparecida Resende i Jaqueline Lopes Damasceno mieli pełny dostęp do wszystkich danych w tym badaniu i biorą odpowiedzialność za integralność danych i dokładność ich analizy.

Konflikty interesów

Autorzy nie mają konfliktów interesów do ujawnienia.

Wkład Autorów

Yadira Fernández Arnet, Giovanna Capaldi Fortunato, Luiza Girotto, Gabriel Davi Marena, Beatriz Patti Rocha, Flávia Aparecida Resende, Sergio Ricardo Ambrosio, Rodrigo Cássio Sola Veneziani, and Jairo Kenupp Bastos made substantial contributions to conception and design, acquisition, analysis, and interpretation of data. Jaqueline Lopes Damasceno, Flávia Aparecida Resende i Carlos Henrique Gomes Martins byli zaangażowani w przygotowanie manuskryptu lub jego krytyczną weryfikację pod kątem ważnych treści intelektualnych. Carlos Henrique Gomes Martins i Flávia Aparecida Resende zgodzili się być odpowiedzialni za wszystkie aspekty tej pracy. Wszyscy autorzy przeczytali i zatwierdzili ostateczną wersję manuskryptu.

Podziękowania

Autorzy dziękują CAPES (Koordynacja ds. Poprawy Kadr Szkolnictwa Wyższego), CNPq (Krajowa Rada ds. Rozwoju Naukowego i Technologicznego) i Fundacji Badań Naukowych São Paulo (FAPESP, Granty nr 2011/13630-7 i 2012/25237-0) za wsparcie finansowe oraz Uniwersytetowi Franca za otrzymane wsparcie. Jaqueline Lopes Damasceno była odbiorcą stypendium doktoranckiego CAPES (Coordination for the Improvement of Higher Level-or Education-Personnel).